Lionel - Great experiments in biology - 1918 | L | +

12 May, 2026

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1 La dottrina cellulare e i poteri fondamentali della vita

L’estratto ripercorre il contributo di Schwann alla teoria cellulare, mettendo in guardia contro attribuzioni semplicistiche e riportando la sua argomentazione originale a favore di una spiegazione fisica dei fenomeni organici, fondata sull’indipendenza vitale e sui poteri plastico e metabolico delle singole cellule.

Il brano si apre con una precisazione storiografica: sebbene Schwann abbia dato un apporto decisivo, attribuire a lui (o a Schleiden e Schwann) l’origine della dottrina cellulare contraddice un vasto corpo di evidenze documentali. “origination of the doctrine to Schwann (or to Schleiden and Schwann), as many present-day text writers have done, is contrary to a vast body of well-authenticated documentary evidence” - (fr:273) [l’attribuzione dell’origine della dottrina a Schwann (o a Schleiden e Schwann), come hanno fatto molti autori di testi attuali, è contraria a un vasto corpo di prove documentali ben accreditate]. La storia mostra che “no single person can be credited with the establishment of such a central concept” - (fr:274) [nessuna singola persona può essere accreditata per l’istituzione di un concetto così centrale]. Altri avevano preceduto Schwann nella scoperta della natura cellulare dei viventi e interpretato correttamente la divisione cellulare, mentre lui no. Tuttavia, il suo contributo maggiore risiede probabilmente nella chiara distinzione dei fenomeni cellulari in due classi: “those having to do with plastic, structural, or morphological changes, and those concerning physiological or metabolic changes” - (fr:276) [quelli che riguardano cambiamenti plastici, strutturali o morfologici, e quelli relativi a cambiamenti fisiologici o metabolici]. Viene inoltre riconosciuta un’esposizione limpida della selettività del metabolismo e della sua dipendenza da membrane polarizzate e a permeabilità differenziale (fr:277).

Il cuore filosofico del testo si trova nella dicotomia tra due concezioni dei poteri fondamentali di un corpo organizzato. La prima è la visione teleologica: “every organism originates with an inherent power, which models it into conformity with a predominant idea” - (fr:279) [ogni organismo trae origine da un potere intrinseco, che lo modella conformandolo a un’idea predominante], una potenza che agisce per uno scopo definito, affine a un principio immateriale cosciente. La seconda è la visione fisica, secondo cui i poteri degli organismi concordano essenzialmente con quelli inorganici, operando “altogether blindly according to laws of necessity and irrespective of any purpose” - (fr:284) [del tutto ciecamente secondo leggi di necessità e senza riguardo ad alcuno scopo]. L’esempio dell’infiammazione come “sforzo dell’organismo” illustra la spiegazione teleologica; per la visione fisica, tale spiegazione è tanto inadeguata quanto dire che il moto terrestre sia uno sforzo per produrre le stagioni (fr:291). In fisica, le spiegazioni teleologiche come l’horror vacui sono state abbandonate; in biologia, benché l’adattamento individuale sia marcato, “it conduces much more to the object of science to strive, at least, to adopt the physical explanation” - (fr:295) [giova molto di più allo scopo della scienza sforzarsi, almeno, di adottare la spiegazione fisica].

Assumere il punto di vista fisico significa chiedersi se la causa dei fenomeni organici risieda nell’intero organismo o nelle sue parti elementari. Due sono le idee: la prima pone la causa nella totalità, da cui scaturirebbe un potere sistemico; la seconda postula che “each separate elementary part is possessed of an independent power, an independent life, so to speak” - (fr:305) [ciascuna parte elementare separata possiede un potere indipendente, una vita indipendente, per così dire]. In quest’ultimo caso, la totalità dell’organismo è condizione, non causa. Per decidere, occorre appellarsi ai risultati dell’indagine morfologica: tutti i corpi organizzati sono composti di parti essenzialmente simili, le cellule, che si formano e crescono secondo leggi simili. Se alcune di queste parti, non diverse dalle altre, sono capaci di separarsi e crescere indipendentemente, si deve concludere che ogni cellula possiede tale potere. Le uova animali offrono esempi di cellule indipendenti che crescono fuori dall’organismo (fr:311); l’obiezione che l’uovo fecondato sia diverso cade per le classi composte da soli individui femminili, per le spore delle piante inferiori e per intere piante costituite da cellule che si possono separare e coltivare da sole, provando così una vitalità indipendente (fr:313-314). Poiché tutte le cellule crescono secondo le stesse leggi e alcune dimostrano uno sviluppo autonomo, “we must ascribe to all cells an independent vitality” - (fr:315) [dobbiamo ascrivere a tutte le cellule una vitalità indipendente]. La causa della nutrizione e della crescita risiede dunque non nell’organismo intero ma nelle singole cellule (fr:316). Il venir meno della crescita di una cellula separata non è un’obiezione, così come non lo è per l’ape che muore fuori dallo sciame: la manifestazione del potere cellulare dipende dalle condizioni offerte dall’organismo (fr:317-318). La questione del potere fondamentale degli organismi si risolve perciò in quella dei poteri delle singole cellule (fr:319).

Per spiegare i fenomeni cellulari, Schwann li raggruppa in due categorie naturali: fenomeni plastici, relativi alla combinazione delle molecole per formare la cellula, e fenomeni metabolici, risultanti da cambiamenti chimici nelle particelle della cellula o nel citoblastema circostante (fr:321). La causa sconosciuta dei processi di formazione è chiamata potere plastico delle cellule (fr:323). Esso si manifesta innanzitutto come una forza di attrazione che opera già all’inizio della cellula (fr:325) e può essere uniforme o localizzata in punti determinati, causando una crescita diseguale e conseguenti cambiamenti di forma (fr:326). L’attrazione mostra una certa elezione: non preleva tutte le sostanze dal citoblastema, ma solo alcune, sia analoghe a quelle già presenti (assimilazione), sia chimicamente differenti (fr:327-328). I diversi strati della cellula – nucleolo, nucleo e membrana – crescono per assimilazione, ma la formazione di un nuovo strato attira materiali diversi da quelli dello strato precedente (fr:329).

Tuttavia, le manifestazioni del potere plastico presuppongono un’altra facoltà. Il citoblastema contiene gli elementi costitutivi della cellula in combinazioni differenti, non come semplice soluzione di materiale cellulare già formato (fr:332). Le cellule, quindi, non solo attraggono materiali, ma devono possedere la facoltà di indurre cambiamenti chimici nelle particelle costituenti (fr:333). Inoltre, tutte le parti della cellula possono essere chimicamente alterate durante la sua vegetazione. La causa ignota di questi fenomeni è designata come potere metabolico (fr:335).

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2 Riorganizzazione cellulare nelle spugne e limiti dell’individualità

Un metodo per dissociare meccanicamente il tessuto di spugna, ottenere sospensioni di cellule vive e seguirne la riaggregazione spontanea fino alla formazione di una spugna funzionale, con una riflessione sulle implicazioni per la teoria cellulare e il concetto di individuo.

Il testo descrive una procedura sperimentale classica per lo studio della coesione cellulare e della rigenerazione nelle spugne. Si parte dalla dissezione meccanica del materiale: “Lobes of the sponge are cut into small pieces with scissors and then strained through fine bolting cloth such as is used for tow nets.” – (fr:375) [Lobi della spugna vengono tagliati in piccoli pezzi con forbici e poi filtrati attraverso un tessuto a maglia fine come quello usato per i retini da plancton.]. I frammenti di spugna vengono poi avvolti in un panno piegato a sacchetto e immersi in acqua di mare filtrata (fr:376). Tenendo il sacchetto chiuso con le dita, lo si comprime con una pinzetta: “The pressure and the elastic recoil of the skeleton break up the living tissue of the sponge into its constituent cells, and these pass out through the pores of the bolting cloth into the surrounding water.” – (fr:378) [La pressione e il ritorno elastico dello scheletro sminuzzano il tessuto vivente della spugna nelle sue cellule costituenti, che fuoriescono attraverso i pori del tessuto nell’acqua circostante.].

La sospensione cellulare che si ottiene è così densa da apparire come una nuvola rossa; le cellule si depositano rapidamente sul fondo della piastra come un sedimento fine (fr:379). In questa fase mostrano subito attività ameboide e aderiscono al substrato, iniziando immediatamente a fondersi tra loro: “Moreover they begin at once to fuse with one another.” – (fr:382) [Inoltre iniziano subito a fondersi l’una con l’altra.]. Dopo un tempo sufficiente per l’adesione, l’acqua viene sostituita con acqua di mare pulita (fr:383). Le cellule vengono poi staccate dal fondo con una pipetta e raccolte al centro della piastra. A questo punto la fusione è progredita al punto che il tessuto si presenta come minute palline o conglomerati cellulari di forma più o meno arrotondata, simili a piccole uova di invertebrati (fr:385). L’esame microscopico mostra che, accanto a queste masse, esistono ancora cellule libere, ma i conglomerati le inglobano costantemente (fr:386).

I conglomerati, descritti come vere masse sinciziali, sono facilmente manipolabili: con una pipetta possono essere distribuiti su vetrini coprioggetto, vetrini portaggetto, tessuti o vetri da orologio (fr:387-388). “The cell conglomerates which are true syncytial masses throw out pseudopodia all over the surface and neighboring conglomerates fuse together to form larger masses, some rounded, some irregular.” – (fr:389) [I conglomerati cellulari, che sono vere masse sinciziali, emettono pseudopodi su tutta la superficie e conglomerati vicini si fondono formando masse più grandi, alcune arrotondate, altre irregolari.]. Dapprima compatti e tondeggianti, col tempo questi sincizi si appiattiscono diventando incrostanti (fr:392). La fusione prosegue fino a che l’intero coprioggetto può essere occupato da un’unica incrostazione o da poche di esse (fr:393).

Osservando i preparati a intervalli si assiste a un progressivo differenziamento. “The dense homogeneous syncytial mass first develops at the surface a thin membrane with underlying connective tissue (collenchyma).” – (fr:395) [La massa sinciziale densa e omogenea sviluppa dapprima in superficie una sottile membrana con sottostante tessuto connettivo (collenchima).]. Compaiono poi in grande abbondanza camere flagellate, canali che inizialmente sono spazi isolati e si connettono tra loro, e corti tubi osculari con osculi terminali che si ergono come proiezioni verticali dall’incrostazione (fr:396-398). Le correnti d’acqua in uscita dagli osculi sono facilmente osservabili e, montando il coprioggetto in posizione capovolta su un vetrino, si possono seguire i movimenti dei flagelli delle cellule a collaretto con un obiettivo ad alta potenza (Zeiss 2 mm). Il testo segnala in questo punto un riferimento a una figura con il rimando [19] (fr:400).

Il grado di differenziazione descritto viene raggiunto in sei o sette giorni in acquari da laboratorio, mentre procede più rapidamente se il preparato è sospeso in mare aperto in una gabbia protettiva (fr:401-402). Spugne così allevate sono state mantenute per circa due settimane, mostrando correnti d’acqua attive e aspetto sano (fr:403-404). Le spicole presenti in queste spugne rigenerate provengono in parte dall’organismo parentale, trasportate insieme alle cellule spremute (fr:405).

L’ultima parte del testo affronta la questione dell’individualità. La Microciona, spugna monaxonide priva di forma definita e con un numero di osculi semplicemente proporzionale alla massa, può essere considerata dal punto di vista filogenetico come un cormo, ma viene comunemente chiamata individuo (fr:407-408). “Yet it is an indi¬vidual of which with the stroke of a knife we can make two.” – (fr:409) [Eppure è un individuo dal quale, con un colpo di bisturi, possiamo farne due.]. “Or conversely it is an individual which may be made to fuse with another, the two forming one.” – (fr:410) [O, al contrario, è un individuo che può essere fatto fondere con un altro, in modo che i due ne formino uno solo.]. Il passo mette così in discussione la nozione stessa di individualità in organismi modulari che possono essere sezionati o fusi senza perdere la capacità di vitale riorganizzazione. Un dettaglio curioso è la comparsa dell’intestazione “THE CELL THEORY” all’interno della frase (fr:384), probabilmente residuo di un titolo di sezione dell’opera originale, che interrompe la narrazione descrittiva e sottolinea il contesto teorico in cui si inseriscono questi esperimenti.

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3 Le Origini dell’Enzimologia Moderna: Diastasi e Zimasi

Due scoperte fondamentali, l’isolamento della diastasi e la fermentazione acellulare, segnarono il passaggio da una comprensione vitalistica a una chimica dei processi biologici.

Il resoconto ripercorre due tappe cruciali nella storia della biochimica, documentando l’isolamento del primo enzima vegetale e la successiva dimostrazione che la fermentazione non richiede cellule vive. Il primo studio, condotto da Payen e Persoz, affrontò l’impresa di isolare un principio attivo vegetale “without any prior knowledge of the chemical nature of the agent or its properties” - (fr:528) [senza alcuna conoscenza preliminare della natura chimica dell’agente o delle sue proprietà]. La loro unica guida nella procedura di isolamento era “its digestive effect upon the starch substrate” - (fr:529) [il suo effetto digestivo sul substrato di amido].

Nonostante questi ostacoli, Payen e Persoz riconobbero precocemente due proprietà fondamentali del loro principio digestivo: la termolabilità, poiché veniva “destroyed by heat” - (fr:530) [distrutto dal calore], e la presenza in “extremely low concentrations” - (fr:531) [concentrazioni estremamente basse]. Un contributo tecnico notevole fu l’uso della precipitazione frazionata con alcol e acetato di piombo, procedure che “still useful in modern enzyme studies, were in a large measure responsible for the successful isolation of diastase at this early date” - (fr:533) [ancora utili nei moderni studi enzimatici, furono in larga misura responsabili del successo dell’isolamento della diastasi in quella data precoce].

La sostanza isolata fu descritta con precisione: “it is solid, white, amorphous, insoluble in alcohol, soluble in water and dilute alcohol; its aqueous solution is neutral and without any pronounced taste” - (fr:540) [è solida, bianca, amorfa, insolubile in alcol, solubile in acqua e alcol diluito; la sua soluzione acquosa è neutra e senza alcun gusto pronunciato]. La proprietà distintiva che le valse il nome fu la capacità di separare rapidamente gli involucri dell’amido dalla destrina solubile. “This singular separating property has prompted us to give the substance that possesses it the name of diastase, which exactly expresses this fact” - (fr:541) [Questa singolare proprietà di separazione ci ha spinto a dare alla sostanza che la possiede il nome di diastasi, che esprime esattamente questo fatto], dove il termine greco diastasis significa separazione.

La scoperta ebbe anche immediate ricadute pratiche e teoriche. Gli autori ne indicarono l’utilità “for the analysis of starch products and the industrial production of dextrins and sugars from starch” - (fr:535) [per l’analisi dei prodotti amidacei e la produzione industriale di destrine e zuccheri dall’amido]. Ancora più rilevante fu l’intuizione del ruolo fisiologico dell’enzima nella “synthesis, storage, and translocation of carbohydrate reserves” - (fr:535) [sintesi, immagazzinamento e traslocazione delle riserve di carboidrati] nelle piante. Trovare il principio attivo “near the points where the starch is diminished in the plant” - (fr:568) [vicino ai punti in cui l’amido diminuisce nella pianta] forniva un potente argomento a supporto di questa ipotesi. Il testo sottolinea come, considerando la chimica dell’epoca, “their grasp of the implications of their work is indeed remarkable” - (fr:536) [la loro comprensione delle implicazioni del loro lavoro è davvero notevole]. Un’ingenuità del tempo emerge dall’affermazione di aver ottenuto diastasi “free from nitrogenous matter” - (fr:552) [priva di materia azotata], prontamente corretta da una nota editoriale che ricorda come la natura proteica degli enzimi fu provata solo un secolo dopo da Sumner.

La seconda parte del testo segna un cambio di paradigma con il lavoro di Eduard Buchner. Per quasi sessant’anni, il mondo scientifico era stato diviso da un’aspra controversia tra “organized” and “unorganized” ferments - (fr:581) [fermenti “organizzati” e “non organizzati”], un dualismo concettuale che separava le reazioni mediate da cellule vive da quelle catalizzate da enzimi extracellulari come la diastasi. L’esperimento risolutivo avvenne accidentalmente: nel tentativo di conservare estratti di lievito con zucchero, Buchner osservò che “vigorous fermentation occurred in his cell-free yeast extracts” - (fr:583) [avveniva una vigorosa fermentazione nei suoi estratti di lievito privi di cellule]. Era la prova che “it was not yeast cells themselves, but rather the materials which could be separated from them that were the actual ferments” - (fr:584) [non erano le cellule di lievito stesse, ma piuttosto i materiali che potevano essere separati da esse a costituire i veri fermenti].

La preparazione del succo attivo prevedeva la macinazione di lievito di birra con sabbia di quarzo e farina fossile, seguita da pressatura idraulica a “4—500 atmospheres” - (fr:591) [4-500 atmosfere], ottenendo da un chilo di lievito circa 500 cc di succo. La proprietà più interessante di questo liquido opalescente era la capacità di fermentare carboidrati come saccarosio, glucosio e maltosio, mentre non fermentava lattosio o mannitosio, coerentemente con il comportamento delle cellule di lievito vive. Cruciale fu la dimostrazione che la filtrazione attraverso un filtro Berkefeldt, “which certainly retains all yeast cells” - (fr:604) [che certamente trattiene tutte le cellule di lievito], non aboliva il potere fermentativo. Buchner designò il principio attivo termolabile e idrosolubile come zimasi, un complesso enzimatico che oggi sappiamo coinvolgere “at least twelve distinct enzymes” - (fr:587) [almeno dodici enzimi distinti] associati ai mitocondri.

Lo studio riporta ulteriori dettagli sperimentali, come l’inibizione della fermentazione a temperature sorprendentemente basse: riscaldando il succo a 40-50°C, l’attività fermentativa si perdeva, suggerendo che la sostanza attiva “either loses its activity at this surprisingly low temperature or else that it coagulates and precipitates out” - (fr:614) [o perde la sua attività a questa temperatura sorprendentemente bassa oppure coagula e precipita]. Questa osservazione confermava la natura proteica del principio attivo. Il testo si conclude con una nota editoriale che contestualizza la portata del lavoro, ricordando come la chimica degli enzimi e la struttura delle proteine rappresentassero ancora “research problems a century and a quarter later” - (fr:571) [problemi di ricerca un secolo e un quarto dopo], a testimonianza della complessità del campo inaugurato da questi pionieri.

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4 Il ruolo del ferro e l’azione del monossido di carbonio sull’enzima respiratorio

La dimostrazione che il metallo pesante dell’enzima respiratorio è il ferro passò attraverso il superamento di modelli inadeguati e l’impiego combinato dell’inibizione da monossido di carbonio e della fotodissociazione.

La ricerca sull’enzima responsabile della respirazione cellulare si è a lungo confrontata con modelli chimici imperfetti. Due modelli avevano in comune la presenza di un “heavy metal capable of change of valence” – (fr:883) [metallo pesante capace di cambiare valenza]. Il secondo modello appariva superiore al primo “because it replaces platinum, which never occurs in cells, by a metal which occurs in all cells and which is necessary to life” – (fr:882) [perché sostituisce il platino, che non si trova mai nelle cellule, con un metallo che è presente in tutte le cellule ed è necessario alla vita]. L’analogia con l’azione enzimatica, che a Berzelius era sembrata così notevole, trovava una base concreta: “If iron is, as we shall see, the active atom of the respiration enzyme, then we understand the analogy which seemed so remarkable to Berzelius” – (fr:884) [Se il ferro è, come vedremo, l’atomo attivo dell’enzima respiratorio, allora comprendiamo l’analogia che sembrò così notevole a Berzelius]. Tale analogia “was by no means formal; on the contrary, it is deeply founded in the chemical nature of both model and enzyme” – (fr:885) [non era affatto formale; al contrario, è profondamente fondata nella natura chimica sia del modello sia dell’enzima].

Storicamente, il modello di Davy “satisfied the scientific mood of its time” – (fr:886) [soddisfaceva lo spirito scientifico del suo tempo], ma quando le idee sull’azione enzimatica cambiarono, il modello a base di emina e carbone apparve contrario al sentire scientifico dominante. “Nearly all leading scientists working on enzyme action opposed it” – (fr:888) [Quasi tutti gli scienziati di punta che lavoravano sull’azione enzimatica vi si opposero]. Tuttavia, la generazione più giovane ritenne che se i fenomeni concordano anche le sostanze devono concordare, e “concentrated its attention on iron” – (fr:889) [concentrò la sua attenzione sul ferro]. Su questa strada furono scoperte numerose catalisi di importanza fisiologica. Emerse che la cisteina, l’unico componente cellulare apparentemente auto-ossidabile, “is not really auto-oxidizable, but is oxidized only in the presence of heavy metals” – (fr:891) [non è realmente auto-ossidabile, ma è ossidata solo in presenza di metalli pesanti]. Il gruppo SH della cisteina lega ferro, rame e manganese a componenti complessi, e “what seemed to be the auto-oxidation of cysteine is nothing else than the valency change of these complex-linked heavy metals” – (fr:893) [ciò che sembrava auto-ossidazione della cisteina non è altro che il cambiamento di valenza di questi metalli pesanti legati a complessi]. Così “a main position of the purely organic enzyme theory was lost” – (fr:894) [una posizione fondamentale della teoria puramente organica degli enzimi andò perduta].

L’esperimento decisivo a favore della teoria del ferro riguardò l’inibizione della respirazione da monossido di carbonio. Tre reagenti per metalli pesanti inibiscono la respirazione cellulare: acido cianidrico, idrogeno solforato e monossido di carbonio, e “the most important of the three is carbon monoxide” – (fr:898) [il più importante dei tre è il monossido di carbonio]. Il monossido di carbonio è un gas indifferente verso le sostanze organiche prive di metalli pesanti, ma “is bound reversibly by many simple and complex heavy metal salts” – (fr:901) [è legato in modo reversibile da molti sali semplici e complessi di metalli pesanti]. Claude Bernard, ottant’anni prima, aveva studiato se il monossido di carbonio reagisse solo con l’emoglobina o anche con le cellule. Non trovando effetti sulle cellule, il monossido di carbonio fu considerato un tipico veleno del sangue. Un esperimento di John Haldane sembrò confermare questa idea: topi che respiravano aria con monossido di carbonio tale da spostare tutto l’ossigeno dall’emoglobina morivano per soffocamento, ma se la pressione parziale dell’ossigeno veniva aumentata fino a due atmosfere, “the animals did not die, though all the oxygen was displaced from the hemoglobin by carbon monoxide” – (fr:909) [gli animali non morivano, sebbene tutto l’ossigeno fosse stato spostato dall’emoglobina dal monossido di carbonio]. A pressione più elevata, il plasma conteneva ossigeno disciolto a sufficienza per le cellule, quindi sembrava definitivamente provato che solo il trasporto di ossigeno fosse inibito.

Tuttavia, questi esperimenti erano esatti, eppure “carbon monoxide does inhibit cell respiration” – (fr:912) [il monossido di carbonio inibisce la respirazione cellulare]. La differenza risiedeva nella pressione necessaria: per spostare l’ossigeno dall’emoglobina bastano pochi decimi di percento di CO, mentre “to inhibit the respiration of the cells a carbon monoxide pressure of the order of magnitude of one atmosphere is needed” – (fr:915) [per inibire la respirazione delle cellule è necessaria una pressione di monossido di carbonio dell’ordine di grandezza di un’atmosfera]. Per questo Bernard, abituato alle basse pressioni degli esperimenti con l’emoglobina, non poté osservare l’effetto. L’inibizione dipende inoltre non solo dalla pressione di CO, ma anche da quella di ossigeno: “the lower the oxygen pressure, the more pronounced is the inhibition of the respiration at the same carbon monoxide pressure” – (fr:918) [quanto più bassa è la pressione di ossigeno, tanto più pronunciata è l’inibizione della respirazione a parità di pressione di monossido di carbonio]. L’enzima respiratorio si distribuisce tra CO e O₂ secondo la stessa legge che governa l’emoglobina: “Let FeO₂ and FeCO be the concentrations of the enzyme linked to oxygen and carbon monoxide, respectively. Then the distribution of the enzyme between the two gases is determined by the law FeO₂/FeCO = K · P_O₂/P_CO” – (frr:921-922) [Siano FeO₂ e FeCO le concentrazioni dell’enzima legato a ossigeno e monossido di carbonio, rispettivamente. Allora la distribuzione dell’enzima tra i due gas è determinata dalla legge FeO₂/FeCO = K · P_O₂/P_CO]. Poiché l’inibizione è reversibile e competitiva, “these facts prove that the active part of the respiration enzyme is a heavy metal” – (fr:924) [questi fatti provano che la parte attiva dell’enzima respiratorio è un metallo pesante]. E come il monossido di carbonio sposta l’ossigeno dal ferro dell’emoglobina, così “it displaces the oxygen from the heavy metal of the respiration enzyme” – (fr:926) [sposta l’ossigeno dal metallo pesante dell’enzima respiratorio].

La grande importanza dell’azione del monossido di carbonio sulla respirazione cellulare risiede in una proprietà peculiare dei composti ferro-monossido di carbonio. Scoperto da Mond e Langer nel 1891 per il ferro pentacarbonile, e osservato da Haldane nel 1897 per l’emoglobina, il fenomeno della fotodissociazione si rivelò specifico: “the general experience is that the photochemical dissociation is confined to the iron compounds of carbon monoxide” – (fr:934) [l’esperienza generale è che la dissociazione fotochimica è limitata ai composti di ferro del monossido di carbonio]. Nessun altro composto di metallo pesante che scinda CO alla luce è stato finora trovato. Se si impiega un complesso di ferro come catalizzatore in un trasferimento di ossigeno, e lo si combina con CO, la reazione catalitica sarà inibita al buio, ma “in the light the action of carbon monoxide will disappear because light will set free the catalyst from carbon monoxide” – (fr:938) [alla luce l’azione del monossido di carbonio scompare perché la luce libererà il catalizzatore dal monossido di carbonio].

L’esperimento fu realizzato con ferro porfirina e ferro cisteina come catalizzatori. Nella Figura 1, che rappresenta l’esperimento con la porfirina condotto da H. A. Krebs, l’ossigeno trasferito è riportato in ordinata e il tempo in ascissa; la pendenza della curva misura la velocità di ossidazione. Illuminando e oscurando la soluzione a intervalli, “from the slope of the lower curve one can see that the rate of oxidation increases in the light and falls in the dark” – (fr:945) [dalla pendenza della curva inferiore si vede che la velocità di ossidazione aumenta alla luce e diminuisce al buio], mentre in assenza di CO la luce non ha effetto. La respirazione cellulare si comporta esattamente come questo semplice sistema catalitico. Se si inibisce la respirazione di cellule vive (lievito) con CO e si illuminano le cellule, l’inibizione scompare. La Figura 2 mostra l’esperimento con cellule viventi: a intervalli di 20 minuti le cellule venivano alternate tra luce e buio, e “from the slope of the lower curve one can see that the respiration increases in the light and decreases in the dark” – (fr:954) [dalla pendenza della curva inferiore si vede che la respirazione aumenta alla luce e diminuisce al buio], mentre la respirazione in atmosfera priva di CO rimane inalterata. Poiché “only the iron compounds of carbon monoxide dissociate in the light, it follows from the light experiment with living cells that the heavy metal of the respiration enzyme is iron” – (fr:956-957) [poiché solo i composti di ferro del monossido di carbonio si dissociano alla luce, dall’esperimento con cellule vive segue che il metallo pesante dell’enzima respiratorio è il ferro].

Questa conclusione, emersa dapprima con cellule di lievito, fu estesa a batteri, semi vegetali, fegato, corion, retina, embrioni di pollo e ratto, tumori, leucociti e piastrine. “All these different cells react in the same way with carbon monoxide. Their respiration enzyme reacts with carbon monoxide reversibly. The enzyme is distributed between carbon monoxide and oxygen according to the law of distribution. The enzyme is sensitive to light when linked to carbon monoxide. That is, in all these cells there is an iron compound which takes up and transfers the oxygen in the process of respiration.” – (frr:961-964) [Tutte queste diverse cellule reagiscono allo stesso modo con il monossido di carbonio. Il loro enzima respiratorio reagisce con il monossido di carbonio in modo reversibile. L’enzima è distribuito tra monossido di carbonio e ossigeno secondo la legge di distribuzione. L’enzima è sensibile alla luce quando è legato al monossido di carbonio. Ciò significa che in tutte queste cellule c’è un composto del ferro che capta e trasferisce l’ossigeno nel processo di respirazione]. Restava da affrontare la natura chimica di tale composto ferrico, che si sapeva già essere presente in forma complessa nella cellula.

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5 L’isolamento e l’identificazione dei cristalli di ureasi: un resoconto sperimentale

Il testo riporta le osservazioni e le argomentazioni con cui Sumner, pioniere della cristallizzazione enzimatica, stabilì la natura proteica e la purezza dell’ureasi, l’enzima che scinde l’urea, ottenuta dal fagiolo jack bean.

Il resoconto si apre con la difficoltà di effettuare determinazioni quantitative precise a causa della scarsità di materiale purificato. L’autore non disponeva di quantità sufficienti per fornire cifre accurate, ma riporta che il contenuto di azoto della preparazione cristallina “GENERAL PHYSIOLOGY figures for its nitrogen content at the present time, but this can be stated to be not far from 17 per cent, as shown by micro-Kjeldahl determinations made on several preparations.” – (fr:1104) [I dati per il suo contenuto di azoto al momento attuale indicano che non è lontano dal 17 per cento, come mostrato da determinazioni micro-Kjeldahl effettuate su diverse preparazioni.]. Parallelamente, “The content of ash is certainly low, so low that a considerable amount of material will have to be used to obtain this figure.” – (fr:1105) [Il contenuto di ceneri è certamente basso, così basso che sarà necessario utilizzare una notevole quantità di materiale per ottenere questa cifra.], a testimonianza della purezza raggiunta.

La misura dell’attività enzimatica presentò anomalie: “Determination of the enzyme activity of the crystals has been somewhat interfered with, owing to the fact that dilute solutions of the crystals produce less ammonia from urea than one would calculate from results obtained from more concentrated solutions.” – (fr:1106) [La determinazione dell’attività enzimatica dei cristalli è stata in parte ostacolata dal fatto che le soluzioni diluite dei cristalli producono meno ammoniaca dall’urea di quanto si calcolerebbe dai risultati ottenuti da soluzioni più concentrate.]. Sumner ipotizzò che “If this effect is real, rather than apparent, it may be due to the instability of the enzyme at great dilutions.” – (fr:1107) [Se questo effetto è reale, piuttosto che apparente, potrebbe essere dovuto all’instabilità dell’enzima a grandi diluizioni.]. La stabilità era invece conservata in condizioni opportune: “When in concentrated solution the activity is not lost very rapidly, provided the material is kept in the ice chest.” – (fr:1108) [Quando si trova in soluzione concentrata, l’attività non si perde molto rapidamente, purché il materiale sia conservato in ghiacciaia.]. Con l’invecchiamento, tuttavia, i cristalli diventavano “entirely insoluble in distilled water, salt solutions, and dilute ammonia.” – (fr:1109) [completamente insolubili in acqua distillata, soluzioni saline e ammoniaca diluita.], e in questo stato “the enzyme activity is almost nil.” – (fr:1110) [l’attività enzimatica è pressoché nulla.]. Ogni tentativo di ricristallizzazione del materiale fresco fallì: “I have made several attempts to purify the fresh crystals by a second crystallization but have never succeeded in obtaining more than traces of crystals and these have been insoluble in water and inactive.” – (fr:1111) [Ho fatto diversi tentativi di purificare i cristalli freschi mediante una seconda cristallizzazione ma non sono mai riuscito a ottenere più che tracce di cristalli, e questi erano insolubili in acqua e inattivi.].

Nonostante le difficoltà tecniche, l’autore sottolinea come la scoperta confermasse le ipotesi precedenti: “It may be worth noting that practically all of our previous ideas concerning the nature of urease appear to be confirmed by the discovery of the octahedral crystals and by study of their properties.” – (fr:1112) [Vale la pena notare che praticamente tutte le nostre idee precedenti sulla natura dell’ureasi sembrano trovare conferma nella scoperta dei cristalli ottaedrici e nello studio delle loro proprietà.]. La scelta dell’ureasi come enzima da isolare era stata dettata da considerazioni precise: “I undertook the task of isolating urease in the fall of 1917 with the idea that it might be found to be a crystallizable globulin, in which case the proof of its isolation would be greatly simplified.” – (fr:1113) [Intrapresi il compito di isolare l’ureasi nell’autunno del 1917 con l’idea che potesse rivelarsi una globulina cristallizzabile, nel qual caso la prova del suo isolamento sarebbe stata grandemente semplificata.]. A ciò si aggiungevano la rapidità e accuratezza della stima quantitativa, la ragionevole aspettativa che si trattasse di un enzima singolo e l’alto contenuto di ureasi nel jack bean, come si poteva dedurre dal parallelismo con altri materiali vegetali e animali (cfr. fr:1114).

Le procedure di purificazione sfruttavano la precipitazione selettiva: “In previous work … it has been found that urease is very completely precipitated, together with the jack bean globulins, by cooling, its 35 per cent alcoholic solution to –5 to –10°C., provided the reaction is sufficiently acid.” – (fr:1115) [In lavori precedenti … si è trovato che l’ureasi viene precipitata in modo molto completo, insieme alle globuline del jack bean, raffreddando la sua soluzione alcolica al 35 per cento a –5 –10°C., purché la reazione sia sufficientemente acida.]. Altre tecniche includevano la precipitazione con acetato di piombo neutro e cloruro di cadmio neutralizzato, seguita da ri-estrazione con ossalato di potassio, oppure la precipitazione con acido tannico senza grave inattivazione, e l’insolubilizzazione con alcol diluito o acido molto diluito, sebbene con perdita di parte dell’attività (fr:1116).

Un punto cruciale riguardava l’esistenza di un coenzima. Sumner rigettava questa ipotesi: “Although the literature contains numerous references to a coenzyme of urease, I believe that no specific coenzyme exists.” – (fr:1117) [Sebbene la letteratura contenga numerosi riferimenti a un coenzima dell’ureasi, io credo che non esista alcun coenzima specifico.]. La prova risiedeva nel bilancio di attività: “My evidence rests upon the fact that the loss of activity that occurs when the octahedral crystals are separated from a jack bean extract is almost exactly equal to the activity obtained when these crystals are washed with dilute acetone and then dissolved in water.” – (fr:1118) [La mia evidenza si basa sul fatto che la perdita di attività che si verifica quando i cristalli ottaedrici vengono separati da un estratto di jack bean è quasi esattamente uguale all’attività ottenuta quando questi cristalli vengono lavati con acetone diluito e poi disciolti in acqua.]. Aggiungeva che “If anything could separate an enzyme from its coenzyme crystallization might be expected to do so.” – (fr:1119) [Se qualcosa potesse separare un enzima dal suo coenzima, ci si aspetterebbe che la cristallizzazione lo faccia.]. La perdita di attività nei passaggi si spiegava piuttosto con la rimozione di proteine e polisaccaridi che esercitano un’azione protettiva colloidale e tampone (fr:1120).

A sostegno dell’identità tra i cristalli ottaedrici e l’enzima ureasi, Sumner elenca quattro ragioni. La prima è “The fact that the crystals can be seen by the microscope to be practically uncontaminated by any other material.” – (fr:1123) [Il fatto che i cristalli possano essere visti al microscopio come praticamente non contaminati da altro materiale.]. La seconda è “The great activity of solutions of the crystals.” – (fr:1125) [La grande attività delle soluzioni dei cristalli.]. La terza è “The fact that solvents which do not dissolve the crystals extract little or no urease and that to obtain solutions of urease one must dissolve the crystals.” – (fr:1127) [Il fatto che i solventi che non dissolvono i cristalli estraggono poca o nessuna ureasi e che per ottenere soluzioni di ureasi si devono dissolvere i cristalli.]. La quarta è “The fact that the other crystallizable jack bean globulins, concanavalin A and B, carry with them very little urease when they are formed from solutions that are comparatively rich in urease.” – (fr:1129) [Il fatto che le altre globuline cristallizzabili del jack bean, concanavalina A e B, portano con sé pochissima ureasi quando si formano da soluzioni che sono relativamente ricche di ureasi.]. Quest’ultimo dato escludeva che l’attività enzimatica fosse un contaminante aspecifico delle proteine cristallizzabili del seme.

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[6.1/1-128-1222|1348]

6 Esperimenti pionieristici su ormoni testicolari e meccanismi chimici della secrezione

L’affermarsi del concetto di messaggero chimico endogeno attraverso trapianti testicolari nel gallo e la dimostrazione del controllo umorale della secrezione pancreatica.

Il testo riunisce due filoni fondamentali della fisiologia sperimentale ottocentesca e dei primi del Novecento: la dimostrazione dell’azione ormonale del testicolo mediante auto-trapianto e la scoperta della secretina come primo esempio di messaggero chimico circolante. La sezione iniziale tratteggia l’identificazione del testosterone, definito “the most potent androgen yet obtained” e ritenuto dalla maggior parte degli studiosi identico all’ormone prodotto dal testicolo (fr:1222). La sostanza, isolata in forma cristallina nel 1935, fu chiamata testosterone (fr:1221). Diverse linee di evidenza – istochimica, citologica e lo studio della degenerazione testicolare nel criptorchidismo – indicavano che il sito principale di produzione è il tessuto interstiziale del testicolo (fr:1223).

Ben più estesa è la descrizione degli esperimenti condotti da Arnold Adolph Berthold nel 1848-1849, riportati con dovizia di particolari anatomici e comportamentali. Il 2 agosto 1848 Berthold castrò sei giovani galletti, di età compresa fra due e tre mesi, senza asportare bargigli, creste o speroni (fr:1224-1225). In due animali (a e d) furono rimossi entrambi i testicoli: essi assunsero il tipico comportamento da cappone – timidi, raramente coinvolti in combattimenti fiacchi, dalla voce alterata – e svilupparono creste e bargigli pallidi e poco sviluppati (fr:1227-1228). Alla dissezione, eseguita il 20 dicembre, si trovò una cicatrice appena percettibile nella sede testicolare e dotti spermatici sottili come fili (fr:1229-1230).

Negli altri quattro animali Berthold realizzò varianti di trapianto. Nei galletti b ed e fu asportato un solo testicolo e l’altro venne lasciato “isolated in the body cavity” (fr:1231). Nei galletti c ed f entrambi i testicoli furono estratti e poi scambiati: un testicolo di c fu inserito nella cavità di f tra le anse intestinali, e viceversa (fr:1232). Tutti e quattro mostrarono comportamento da animali integri: cantavano normalmente, lottavano, manifestavano attrazione per le galline e sviluppavano creste e bargigli normali (fr:1233). Il gallo b, ucciso il 4 ottobre, rivelò un testicolo riattecchito in sede originaria, irrorato e contenente tubuli seminiferi ben visibili; dal taglio fuoriusciva un liquido biancastro con cellule, ma senza spermatozoi riconoscibili (fr:1234).

Lo stesso giorno Berthold recise le creste di c, e, f e aprì la cavità corporea. Nel gallo e il testicolo era in posizione normale e in condizioni simili a quelle di b; rimosso, comportò la rapida cicatrizzazione della cresta senza rigenerazione e la trasformazione dell’animale in un vero cappone, con il tipico verso, indifferenza alle galline e isolamento (fr:1236-1238). Nei galletti c ed f, invece, non si trovò alcuna traccia di testicolo nella sede originaria, eppure creste e bargigli si rigenerarono e il comportamento da gallo rimase intatto (fr:1239-1240). La dissezione finale, il 30 gennaio 1849, svelò che in entrambi i testicoli si erano innestati sulla superficie dorsale del colon, irrorati da rami dei vasi mesenterici, e che, sezionati, emettevano un liquido bianco latteo con odore di sperma di gallo (fr:1242-1246). L’esame microscopico evidenziò numerose cellule di diametro compreso fra 5 e 15 micron e “numerous spermatozoa with the most beautiful flagellar movements”, rese ancor più vivaci dall’aggiunta di una goccia d’acqua (fr:1247).

Berthold trasse quattro conclusioni. Anzitutto i testicoli sono organi trapiantabili e attecchiscono sia nella sede originaria sia in sedi estranee come la parete intestinale (fr:1248). In secondo luogo, il testicolo trapiantato cresce, sviluppa i tubuli seminiferi e secerne uno sperma normale contenente spermatozoi; l’Autore istituisce un parallelo con gli innesti vegetali, che producono frutti conformi al nesto e non al portainnesto (fr:1249-1250). In terzo luogo, poiché un testicolo innestato sull’intestino, quindi privo di connessioni nervose originali, continua a funzionare come organo spermatogenico, si deve escludere l’esistenza di specifici nervi seminali o trofici del simpatico – un argomento stringente contro concezioni fisiologiche coeve (fr:1251-1255). L’annotazione editoriale precisa che “when a nerve is cut, the fibers distal to the cut degenerate” e solo le fibre prossimali possono rigenerare, sottolineando che Berthold dimostrò più di quanto egli stesso comprese (fr:1253-1254). La quarta conclusione riguarda il rapporto consensuale e antagonistico tra vita individuale e vita della specie: la voce, la pulsione riproduttiva, la combattività e lo sviluppo di cresta e bargigli permangono quando i testicoli sono trapiantati in sedi anomale, il che implica che tali caratteri siano condizionati da una relazione produttiva del testicolo mediata dal sangue e, attraverso questo, dall’organismo intero, sistema nervoso incluso (fr:1256-1258).

La seconda metà del testo ripercorre la scoperta del meccanismo chimico della secrezione pancreatica esterna. Dopo un preambolo che ricorda come Claude Bernard proponesse già nel 1872 un effetto stimolante di sostanze intestinali sulla secrezione pancreatica, e come Bernard, Pavlov e altri attribuissero il fenomeno a un riflesso nervoso (fr:1264-1265), il resoconto introduce gli esperimenti di Bayliss e Starling del La communis opinio nervosa era già incrinata dalle osservazioni di Wertheimer e Lepage su animali uniti parabolicamente, che suggerivano mediatori chimici veicolati dal sangue (fr:1266); fu in questo contesto che i due fisiologi realizzarono la loro scoperta. L’agente attivo della secrezione pancreatica veniva liberato dalla mucosa intestinale in seguito all’azione dell’acido cloridrico proveniente dallo stomaco, assorbito direttamente nel torrente circolatorio e dotato di effetto specifico sul pancreas (fr:1268-1269).

Il testo espone dettagliatamente gli esperimenti condotti su cani anestetizzati con morfina e miscela A.C.E., mantenuti in vasca di soluzione fisiologica calda e in respirazione artificiale (fr:1301-1305). La pressione arteriosa era registrata con manometro a mercurio, mentre il succo pancreatico, raccolto mediante cannula nel dotto maggiore, veniva contato goccia a goccia su un chimografo tramite tamburo di Marey (fr:1306-1308).

L’iniezione di 30-50 c.c. di acido cloridrico allo 0,4% nel duodeno o digiuno produceva, dopo una latenza di circa due minuti, un marcato flusso pancreatico (fr:1313). Tale effetto persisteva dopo sezione dei vaghi, del midollo spinale a livello del foramen magnum, dei nervi splancnici, distruzione del midollo o estirpazione del plesso solare, e qualunque combinazione di tali interventi (fr:1314). Restava tuttavia da eseguire l’experimentum crucis: la stimolazione di un’ansa intestinale completamente isolata dal punto di vista nervoso. Il 16 gennaio 1902 essi operarono una cagna di circa 6 kg, asportando le masse nervose attorno all’arteria mesenterica superiore e all’asse celiaco, sezionando entrambi i vaghi, e isolando un’ansa di digiuno con sola connessione vascolare (fr:1322-1324). L’introduzione di 20 c.c. di HCl 0,4% nel duodeno produsse una secrezione di una goccia ogni 20 secondi per circa 6 minuti, confermando i dati precedenti. Il momento cruciale fu che “the introduction of 10 c.c. of the same acid into the enervated loop of jejunum produced a similar and equally well-marked effect” (fr:1329). Poiché l’ansa era del tutto priva di connessioni nervose con il pancreas, la conclusione inevitabile fu che l’effetto fosse mediato da una sostanza chimica veicolata dal sangue (fr:1330). Poiché l’acido iniettato direttamente in circolo non aveva effetto (fr:1331), si ipotizzò che l’acido agisse sulle cellule epiteliali liberando un corpo eccitante.

Il passo successivo consisté nel raschiare la mucosa dell’ansa, omogeneizzarla con sabbia e HCl 0,4% e iniettare l’estratto filtrato in vena (fr:1335). Si osservò un calo pressorio seguito, dopo circa 70 secondi, da un flusso pancreatico oltre due volte superiore a quello iniziale (fr:1336). Il principio attivo fu battezzato “secretin” (fr:1337). L’estratto bollito manteneva inalterata l’attività, segno che non si trattava di un enzima (fr:1339). Venne inoltre mappata la distribuzione del precursore, detto “prosecretin”, lungo l’intestino tenue: un estratto dagli ultimi 15 cm dell’ileo non produceva secrezione pancreatica, mentre preparati di digiuno via via più alti davano effetti progressivamente maggiori, esattamente corrispondenti alla regione da cui l’acido introdotto nel lume evocava secrezione (fr:1340-1344).

L’ultima brevissima sezione introduce un lavoro di Banting e Best del 1922 sulla secrezione interna del pancreas (fr:1345-1348). Pur limitandosi ai dati bibliografici, essa completa idealmente il percorso che dal concetto di ormone testicolare di Berthold conduce agli sviluppi novecenteschi dell’endocrinologia, collegando la dimostrazione ottocentesca dell’azione umorale del testicolo con l’isolamento della secretina e, infine, con la scoperta dell’insulina.

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7 Dalla funzione endocrina del pancreas alla trasmissione chimica dell’impulso nervoso: un capitolo di fisiologia generale

Il testo ripercorre, attraverso esperimenti e osservazioni, il cammino che ha portato a identificare le isole di Langerhans come sede della secrezione interna pancreatica e a dimostrare, con l’estratto di pancreas degenerato, l’esistenza di un ormone capace di controllare il metabolismo glucidico. A questo nucleo si affianca, nella seconda parte, la classica dimostrazione di Otto Loewi sulla trasmissione umorale dell’azione del nervo vago.

7.1 Il lungo riconoscimento delle isole pancreatiche

Alla fine dell’Ottocento l’opinione prevalente collocava la funzione endocrina nelle cellule acinose. “Lewaschew believed that the islets were modified acinous cells” – (fr:1382) [Lewaschew credeva che le isole fossero cellule acinose modificate]; tuttavia lo stesso autore, legando i dotti, osservò nelle fasi più avanzate un coinvolgimento delle isole accompagnato da glicosuria (fr:1381). Fu un anatomista, Laguesse, a ipotizzare per primo che le isole rappresentassero l’organo della secrezione interna pancreatica, mostrando come esse fossero relativamente più numerose nel feto e nel neonato rispetto all’adulto (fr:1383-1384). La prima base clinica fu fornita indipendentemente da Opie e Ssobolew, che collegarono le isole al diabete pancreatico (fr:1385).

Seguirono esperimenti di legatura selettiva dei dotti. MacCallum, nel 1909, legò i dotti della coda del pancreas, asportando dopo sette mesi il corpo e la testa della ghiandola: si produsse una glicosuria lieve che divenne estrema e fatale quando, tre settimane dopo, fu rimossa anche la coda degenerata (fr:1386-1390). Kirkbridge ripeté e confermò questi risultati, dimostrando con il metodo di Lane che il tessuto atrofico conteneva isole sane (fr:1391). Kamimura, nel coniglio, seguì i cambiamenti degenerativi del parenchima dopo legatura duttale e accertò che l’animale non sviluppava glicosuria finché le isole restavano integre (fr:1392).

7.2 Tentativi terapeutici e contraddizioni sperimentali

Il primo a cercare di utilizzare il pancreas nei difetti del metabolismo glucidico fu Minkowski, somministrando pancreas per via alimentare, senza alcun beneficio (fr:1393-1394). Anzi, “up to the present time only useless or even harmful effects have been obtained from repeated attempts to use this method” – (fr:1395) [fino ad oggi solo effetti inutili o addirittura dannosi sono stati ottenuti dai ripetuti tentativi di usare questo metodo]. Knowlton e Starling segnalarono una ridotta capacità di utilizzare zucchero nel cuore diabetico perfuso, ma Macleod e Pearce non riuscirono a confermare il dato; Patterson e Starling ne attribuirono l’errore all’eccesso di glicogeno e alla scomparsa irregolare di glucosio dai polmoni (fr:1396-1398).

Murlin preparò un estratto alcalino di pancreas che, iniettato, riduceva lo zucchero urinario, ma Kleiner fece notare che la riduzione poteva dipendere dall’alcali di per sé (fr:1399-1400). Lo stesso Kleiner mostrò che “unfiltered-water extracts of fresh pancreas diluted with .90 per cent NaCl when administered slowly usually resulted in a marked decrease in blood sugar” – (fr:1401) [estratti di pancreas fresco diluiti con NaCl allo 0,90% somministrati lentamente producevano di solito una marcata diminuzione della glicemia], con una diminuzione anche della glicosuria, forse in parte dovuta a un effetto tossico renale transitorio (fr:1402); le stime di emoglobina escludevano un fenomeno di diluizione (fr:1403). Paulesco dimostrò l’effetto riducente dell’estratto di ghiandola intera su zucchero, urea e corpi acetonici, notando però che le iniezioni in vena periferica erano inefficaci e che la seconda iniezione aveva effetto minore della prima (fr:1404-1405).

7.3 L’ipotesi della secrezione interna e la via sperimentale

Dai lavori precedenti gli autori traggono tre conclusioni: le cellule acinose non hanno alcun rapporto con l’utilizzazione dei carboidrati; tutte le iniezioni di estratto di ghiandola intera sono state inutili come misura terapeutica; le isole di Langerhans sono essenziali nel controllo del metabolismo glucidico (fr:1406). Macleod aveva prospettato due possibili meccanismi: il sangue potrebbe essere modificato passando attraverso le isole come stazioni detossicanti, oppure le isole potrebbero produrre una secrezione interna (fr:1407). Vengono qui presentati esperimenti che forniscono “convincing evidence that it is this latter mechanism which is in operation” – (fr:1408) [prove convincenti che è quest’ultimo meccanismo a essere in atto].

7.4 Metodo operatorio e preparazione dell’estratto

Dopo un intervallo di dieci settimane, ritenuto necessario per la completa degenerazione del tessuto acinoso, furono utilizzati cani depancreatizzati con il metodo di Hedon (fr:1409). La procedura prevedeva laparotomia, isolamento della coda pancreatica, legatura e sezione dei vasi splenici, scollamento a secco della ghiandola dal duodeno con attenzione ai vasi pancreatico-duodenali superiori, la cui integrità era indispensabile per evitare l’ulcera duodenale (fr:1410-1421). L’intervento lasciava la ghiandola, tranne la porzione duodenale, ricoperta dal mesentere; la parete addominale era suturata a strati con catgut e medicata con collodio (fr:1422-1425). Erano preferiti animali tra otto e sedici mesi, quando il pancreas non è ancora troppo fissato (fr:1426-1427).

In una serie di cani furono legati i dotti pancreatici; durante l’attesa non fu mai registrata iperglicemia (fr:1428-1430). L’estratto era ottenuto estraendo rapidamente il pancreas degenerato sotto anestesia letale da cloroformio, affettandolo in mortaio con soluzione di Ringer e congelandolo parzialmente; il tessuto semigelato era macerato, filtrato e portato a temperatura corporea per l’iniezione endovenosa (fr:1431-1435). Le iniezioni, comprese quelle massive di zucchero (100 mL), avvenivano per semplice puntura venosa senza anestesia, sfruttando la dilatazione da compressione (fr:1436-1439). I tentativi di esaurire i granuli di zimogeno mediante stimolazione vagale o secretinica fallirono quasi sempre: “Fortune favored us in the first experiment” – (fr:1442) [la fortuna ci favorì nel primo esperimento]; in seguito non si riuscì mai a ottenere un estratto sufficientemente privo degli effetti disturbanti di qualche costituente del succo pancreatico (fr:1440-1443). La glicemia veniva dosata con il metodo di Myers-Bailey, che dava valori costantemente più alti di circa lo 0,01% rispetto al metodo Schaffer-Hartman; in trenta cani normali il valore medio era lo 0,090% (fr:1444-1447). L’emoglobina era misurata con il metodo di saturazione al monossido di carbonio (fr:1448).

7.5 Risultati: l’estratto di pancreas degenerato controlla la glicemia

In un esperimento prototipico, 10 mL di estratto di pancreas degenerato somministrati per via rettale non ebbero effetto; un’ora dopo, 12 mL dello stesso materiale iniettati per via endovenosa fecero scendere la glicemia da 0,30% a 0,21% e, con iniezioni successive, fino a 0,07% (fr:1449-1451). L’estratto di ghiandola esausta, se trattato con succo pancreatico attivo e reso alcalino, perdeva ogni efficacia, mentre l’estratto acido conservava la capacità di ridurre la glicemia (fr:1454-1457). Gli estratti preparati da ghiandole solo parzialmente esaurite conservavano un certo effetto ipoglicemizzante ma provocavano sintomi tossici, assenti con gli estratti completamente degenerati (fr:1459).

Venne poi saggiata la capacità di trattenere zucchero. In un cane con glicemia a 0,35%, l’iniezione di 10 g di glucosio portò la glicemia a 0,40% e fece escretare 10,88 g di zucchero in quattro ore. Somministrato l’estratto (78 mL frazionati) fino a ridurre la glicemia a 0,09%, una nuova dose identica di glucosio fece salire la glicemia soltanto a 0,22% e le stime di emoglobina prima e dopo rimasero identiche (fr:1460-1468). L’esperimento fu interrotto precocemente da un’ulcera duodenale.

Il reperto istologico, dopo sette-dieci settimane di degenerazione, mostrava “an abundance of healthy islets, and a complete replacement of the acini with fibrous tissue” – (fr:1470) [abbondanza di isole sane e una completa sostituzione degli acini con tessuto fibroso]. Avendo somministrato oltre settantacinque dosi a dieci animali diabetici ottenendo sempre una riduzione della glicemia e della glicosuria, gli autori affermano: “we feel justified in stating that this extract contains the internal secretion of the pancreas” – (fr:1473) [ci sentiamo giustificati nell’affermare che questo estratto contiene la secrezione interna del pancreas]. Esperimenti ancora in corso promettevano dati sulla natura chimica del principio attivo e sugli scambi respiratori (fr:1474-1475). Tuttavia la prudenza era d’obbligo: “the results of our experimental work, as reported in this paper, do not at present justify the therapeutic administration of degenerated gland extracts to cases of diabetes mellitus in the clinic” – (fr:1476) [i risultati del nostro lavoro sperimentale, qui riportati, al momento non giustificano la somministrazione terapeutica di estratti di ghiandola degenerata a casi di diabete mellito in clinica].

Una nota editoriale ricorda come la storia dell’insulina abbia spettacolarmente superato queste caute attese: si stima un uso annuo di 90 miliardi di unità negli Stati Uniti, e l’aspettativa di vita dei diabetici è radicalmente mutata. Un trentenne diabetico prima del 1913 aveva circa quattro anni di vita; oggi può raggiungere i sessant’anni. I bambini diabetici, condannati a uno-due anni di sopravvivenza, oggi giungono alla mezza età con una mortalità solo dello 0,3% superiore alla popolazione generale (fr:1477-1480).

7.6 La trasmissione umorale dell’azione nervosa: il contributo di Loewi

Il testo si chiude con la traduzione della comunicazione di Otto Loewi del 1921 sulla trasmissione umorale degli effetti del nervo vago sul cuore. Il redattore sottolinea come Loewi abbia fornito “a simple, elegant, forcefully convincing demonstration that the vagus nerve produces its effects on the frog’s heart by liberating a chemically definable inhibitor substance” – (fr:1486) [una dimostrazione semplice, elegante e vigorosamente convincente che il nervo vago esercita i suoi effetti sul cuore di rana liberando una sostanza inibitrice chimicamente definibile]. Con un metodo divenuto classico, Loewi mostrò che dopo stimolazione vagale una sostanza si accumulava nel fluido del cuore isolato di anfibio e, applicata a un secondo cuore del tutto separato, produceva effetti identici alla stimolazione vagale (fr:1489-1490). Quantunque nel 1926 Loewi e Navratil identificassero la sostanza come acetilcolina, ancora oggi permanevano incertezze sui meccanismi in vivo di liberazione, sintesi, propagazione e distruzione (fr:1491). È singolare che l’acetilcolina fosse stata preparata dai chimici organici una sessantina d’anni prima e che, malgrado la vasta letteratura sui suoi potenti effetti fisiologici – rilevabili a dosi bassissime, fino a un decimilionesimo di milligrammo –, la sua importanza non fosse stata apprezzata prima del lavoro pionieristico di Loewi (fr:1492-1493), che gli valse il Premio Nobel nel 1936 (fr:1494).

Il problema di partenza era il meccanismo d’azione dello stimolo nervoso. Poiché certi farmaci agiscono in modo quasi identico alla stimolazione di nervi specifici, esisteva la possibilità che sotto l’influsso della stimolazione nervosa si formassero sostanze capaci di produrre gli effetti della stimolazione stessa (fr:1496). Ma, osservava Loewi, “under the conditions existing with experimentation on the intact animal, it is quite hopeless to solve this problem” – (fr:1497) [nelle condizioni dell’esperimento sull’animale integro, è del tutto impossibile risolvere questo problema].

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8 L’isolamento della vitamina anti-beriberi: dall’estratto di crusca al principio cristallino

Un resoconto della procedura sperimentale che portò all’ottenimento di una forma cristallina pura del principio attivo contro la polineurite, partendo dalla crusca di riso e utilizzando piccoli uccelli come reagenti biologici.

Il percorso che condusse alla cristallizzazione della vitamina anti-beriberi affonda le sue radici nel lavoro pionieristico di C. Funk, il quale nel 1911 pubblicò il suo primo studio su una sostanza che designò con il nome di “vitamin.” - (fr:1653) [“vitamina”]. Funk descrisse un preparato, una quantità compresa tra 20 e 40 milligrammi, “of which could cure a pigeon that had developed polyneuritis after a diet of polished rice.” - (fr:1654-1655) [in grado di curare un piccione che aveva sviluppato la polineurite dopo una dieta a base di riso brillato]. Divenne però presto evidente che “this was not the ‘vitamin’ sought for.” - (fr:1656) [questa non era la “vitamina” cercata], e la comparsa di sintomi carenziali con una dieta di proteine purificate, grassi, carboidrati e sali rese necessaria l’ipotesi dell’esistenza di diverse vitamine, differenziate con le lettere A e B, e in seguito anche C, D ed E. Dopo Funk, numerosi tentativi di isolare la vitamina B, e in particolare la vitamina anti-beriberi, non avevano portato a risultati positivi.

La svolta avvenne in un luogo storicamente significativo per questo campo di studi. Con grande soddisfazione, gli autori annunciarono di essere riusciti “in isolating the anti-beriberi-vitamin in the same laboratory where Eykman and Gryns have worked.” - (fr:1660) [a isolare la vitamina anti-beriberi nello stesso laboratorio dove hanno lavorato Eykman e Gryns]. Il materiale di partenza scelto furono le fini puliture di riso, note come dedek, un sottoprodotto economico reperibile in India. A partire da un estratto di questo materiale, si procedette con un complesso frazionamento.

Per determinare il contenuto vitaminico delle varie frazioni, fu impiegato un saggio biologico basato su piccoli uccelli granivori, i bondols (Munia maja), definiti “very fit reagents to testify the presence of the antineuritic vitamin, and to determine its content.” - (fr:1666) [reagenti molto adatti per attestare la presenza della vitamina antineuritica e per determinarne il contenuto]. La procedura standard prevedeva gruppi di dieci uccelli alimentati con riso brillato, precedentemente lavato in acqua corrente per 48 ore, a cui si aggiungeva una miscela di sali (simile a quella di Osborne e Mendel) e olio di fegato di merluzzo per compensare le carenze di sali minerali e vitamina A. Con questa dieta carenzata, praticamente tutti gli uccelli sviluppavano polineurite in un intervallo di 9-13 giorni. L’aggiunta del 5% di un dedek di buona qualità prolungava l’insorgenza della malattia a 15-23 giorni. Questo intervallo temporale divenne la base per la standardizzazione: si determinava la quantità di ciascuna frazione da aggiungere al riso lavato affinché gli uccelli manifestassero polineurite proprio entro 15-23 giorni. Considerando un consumo medio di 2 grammi di riso al giorno per uccello, si poté calcolare la dose giornaliera protettiva, che per la maggior parte dei dedek commerciali ammontava a 140 milligrammi.

Il processo di estrazione su larga scala fu ingegnosamente progettato. Il dedek finemente macinato veniva estratto con acqua di rubinetto di Batavia, la quale conteneva solo circa 130 mg di sali disciolti per litro, acidificata con 3-4 cc di acido solforico per litro per raggiungere una precisa acidità (pH finale circa 5), e addizionata con 200 cc di alcol forte per inibire l’azione dei microrganismi, poiché la formalina era sembrata un disinfettante meno favorevole. L’estrazione avveniva in una batteria di quattro tini di legno da circa 40 litri ciascuno, operanti secondo il principio della controcorrente. Il design prevedeva che “The bottom and the lid of each cask was provided with an opening resp. for the affluence and the effluence of the liquid.” - (fr:1676-1677) [Il fondo e il coperchio di ogni tino erano provvisti di un’apertura rispettivamente per l’afflusso e l’efflusso del liquido], con un secondo fondo forato in garza di rame che sosteneva uno strato di sabbia minerale su cui poggiavano 16 kg di dedek. Ogni giorno un tino veniva ricaricato con materiale fresco, facendo avanzare gli altri tre, cosicché il dedek fresco venisse a contatto con il liquido già parzialmente carico dei tini precedenti. In questo modo si riuscivano a estrarre quasi 100 kg di dedek a settimana, ottenendo un estratto contenente circa 20 kg di sostanza solida e praticamente tutta la vitamina presente.

Il risultato del lungo e meticoloso frazionamento fu straordinario per la sua resa infinitesimale. Dai 100 kg di dedek di partenza, la sostanza solida si riduceva ad appena 1,4 grammi. Considerando il contenuto vitaminico iniziale, questo quantitativo sarebbe stato sufficiente a proteggere dalla polineurite circa 000 uccelli al giorno. Proseguendo il frazionamento, da 300 kg di dedek si ottennero infine circa 100 mg di una sostanza cristallina che, anche dopo ricristallizzazione, presentava un punto di fusione di 250°C.

Per dimostrare che questi cristalli fossero effettivamente il principio attivo puro, fu condotta una serie di esperimenti rigorosi. La dose critica fu stabilita con precisione. Gli esperimenti mostrarono che con una diluizione di 1 parte di vitamina cloridrato in 1 milione di parti di riso, corrispondente a una dose di 2 microgrammi (γ) per uccello al giorno, solo un individuo su 30 sviluppò polineurite entro 15 giorni, mentre la maggioranza rimase in salute per oltre 3 settimane. “Of the ricebirds that received 3 y or 4 y hydrochlorid daily not one developed polyneuritis.” - (fr:1705) [Tra gli uccelli che ricevevano 3 γ o 4 γ di cloridrato al giorno, nessuno sviluppò la polineurite]. I risultati, coerenti tra lotti di vitamina purificata per cristallizzazione da alcol assoluto e acetone e lotti purificati via acido picrolonico o tramite decomposizione di un sale doppio, portarono alla solida conclusione che il cloridrato con punto di fusione a 250°C fosse “in a high degree instrumental in warding off polyneuritis.” - (fr:1706) [in alto grado efficace nell’allontanare la polineurite].

Un’ultima, cruciale obiezione venne considerata e confutata: la possibilità che il sale cristallino non fosse la vitamina pura, ma fosse contaminato da una quantità infinitesimale di un composto ancora più attivo. Gli autori ritennero questa supposizione “altogether erroneous” - (fr:1708) [del tutto erronea], basandosi sull’evidenza che il sale era stato purificato per ricristallizzazione e che le acque madri apparivano molto meno attive. Se l’ipotesi del contaminante fosse stata corretta, si sarebbe dovuto ammettere che i cristalli avessero assorbito selettivamente il componente attivo dal liquido, trattenendolo dopo la ricristallizzazione e dopo un ulteriore passaggio chimico a sale d’oro e nuovamente a cloridrato, uno scenario giudicato non plausibile.

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[9.1/1-104-1825|1927]

9 La rivoluzione quantitativa nello studio del calore animale e della respirazione

L’applicazione sistematica della calorimetria a ghiaccio al metabolismo animale trasforma la respirazione in un processo chimico misurabile, equiparabile a una combustione.

Il resoconto si apre con una dichiarazione programmatica che segna un punto di svolta nella fisiologia: “Lavoisier’s and Laplace’s attack on this problem was made possible by their decision to study the production of animal heat by the same quantitative methods that they had applied to non-living chemical reactions.” – (fr:1825) [L’attacco di Lavoisier e Laplace a questo problema fu reso possibile dalla loro decisione di studiare la produzione di calore animale con gli stessi metodi quantitativi che avevano applicato alle reazioni chimiche non viventi.] Da questa scelta metodologica discende una conclusione di portata epocale: “Their devastatingly simple conclusion that respiration is a form of combustion made it clear that the riddles of metabolism could be attacked with the instruments of the chemist and the physicist.” – (fr:1826) [La loro conclusione, devastante nella sua semplicità, che la respirazione è una forma di combustione rese chiaro che gli enigmi del metabolismo potevano essere attaccati con gli strumenti del chimico e del fisico.] L’intero memoir si configura quindi non solo come una serie di esperimenti, ma come l’apertura di un nuovo campo di indagine, “the way was thus opened for the numerous triumphs of nineteenth and twentieth century physiologists” – (fr:1827) [la via fu così aperta ai numerosi trionfi dei fisiologi del XIX e XX secolo].

Il cuore tecnico di questa impresa è un calorimetro a ghiaccio progettato per misurare con precisione il calore sviluppato da combustioni, reazioni chimiche e animali vivi. Gli autori descrivono minuziosamente un apparato a tre camere concentriche. “The inner chamber is constructed of a meshwork of iron wire… the experimental object is placed in this chamber” – (fr:1832) [La camera interna è costruita con una rete di filo di ferro… l’oggetto sperimentale viene posto in questa camera.] La camera mediana è riempita di ghiaccio che, sciogliendosi a contatto con il calore dell’oggetto, fornisce la misura: “in proportion as the ice is melted… the water runs down through the grill and the sieve… and is collected in the vessel placed under the apparatus” – (fr:1834) [man mano che il ghiaccio viene sciolto dal calore dell’oggetto nel recipiente più interno, l’acqua cola attraverso la griglia e il setaccio… e viene raccolta nel recipiente posto sotto l’apparato.] Uno stopcock permette di controllare il deflusso. La camera esterna, anch’essa colma di ghiaccio, funge da scudo termico: “the outer chamber is designed to be filled with ice, the purpose of which is to prevent the entrance of heat from the external air or surrounding objects” – (fr:1835) [la camera esterna è concepita per essere riempita di ghiaccio, con lo scopo di impedire l’ingresso di calore dall’aria esterna o dagli oggetti circostanti.] Una cura meticolosa è rivolta alla preparazione: il ghiaccio va finemente tritato e pressato (fr:1837), e si deve verificare l’assenza di comunicazioni idriche tra camera mediana ed esterna per non invalidare la misura (fr:1841-1842). Le condizioni operative sono critiche: “it is essential to work at temperatures above zero; in cold weather the apparatus must be kept in a heated room” – (fr:1843) [è essenziale lavorare a temperature sopra lo zero; quando fa freddo l’apparato va tenuto in una stanza riscaldata.] Un’ulteriore raffinatezza è la correzione per l’acqua di adesione superficiale del ghiaccio: gli autori notano che “at the beginning of each experiment the ice is already saturated with all the water it can thus retain” – (fr:1844) [all’inizio di ogni esperimento il ghiaccio è già saturo di tutta l’acqua che può trattenere in questo modo], per cui l’acqua che aderisce alle superfici non falsa i risultati.

Il principio di misura è diretto e fondante: “Its weight exactly measures the heat emitted by the object; for clearly all its heat has been absorbed by the inner ice” – (fr:1840) [Il suo peso misura esattamente il calore emesso dall’oggetto; poiché chiaramente tutto il suo calore è stato assorbito dal ghiaccio interno.] Per esperimenti con combustione o respirazione, dove l’aria deve essere rinnovata, viene impiegato un secondo modello dotato di due tubi passanti attraverso i coperchi per insufflare aria con un mantice (fr:1845).

La combustione del carbonio viene analizzata quantitativamente con un protocollo rigoroso. Un crogiolo contenente carboni ardenti del peso esatto di un’oncia viene trasferito rapidamente nell’apparato e la combustione è mantenuta per 32 minuti. Il risultato immediato è che “the apparatus when well-drained yielded 6 pounds, 2 ounces of melted ice” – (fr:1847) [l’apparato ben drenato produsse 6 libbre e 2 once di ghiaccio fuso], ovvero il calore liberato da un’oncia di carbonio. Parallelamente, gli autori conducono esperimenti pneumatochimici per determinare le alterazioni dell’aria “dephlogisticated” (ossigeno). Viene impiegata una campana di vetro su mercurio, con un sistema di livelli per misurare le variazioni di volume (fr:1861-1865). Dopo la combustione del carbone, si introduce alcali caustico per assorbire l’“aria fissa” (anidride carbonica) prodotta. Le misure di volume sono riportate con grande dettaglio e corrette per temperatura e pressione: “we reduced all our experimental results to the values which would have been obtained had the external temperature been 10°” – (fr:1872) [riducemmo tutti i nostri risultati sperimentali ai valori che si sarebbero ottenuti se la temperatura esterna fosse stata di 10°.] I calcoli stechiometrici portano a determinare che “one ounce of carbon, in burning, consumes 5 inches of pure air and forms 1 inches of fixed air” – (fr:1878) [un’oncia di carbonio, bruciando, consuma 4037,5 pollici cubici di aria pura e forma 3021,1 pollici cubici di aria fissa.] In peso, un’oncia di carbonio consuma 3,3167 once di aria pura e produce 3,6715 once di aria fissa (fr:1884). Combinando i dati calorimetrici con quelli pneumatici, si calcola che “the alteration of an ounce of pure air is capable of melting 547 ounces of ice, and that the production of one ounce of fixed air is capable of melting 692 ounces” – (fr:1887) [l’alterazione di un’oncia di aria pura è capace di fondere 29,547 once di ghiaccio, e la produzione di un’oncia di aria fissa è capace di fonderne 26,692.] Nonostante la precisione ostentata, gli autori mostrano una cautela esemplare: “We have performed only one experiment on the heat liberated by this combustion… we shall not be quite confident of its exactness until we have repeated it a number of times” – (fr:1889) [Abbiamo eseguito un solo esperimento sul calore liberato da questa combustione… non saremo del tutto sicuri della sua esattezza finché non l’avremo ripetuto molte volte.] Presentano il loro contributo più come un’innovazione di metodo che come un insieme di dati definitivi, invitando altri naturalisti a confermare le misure (fr:1890).

Il calore animale viene misurato ponendo una cavia nel calorimetro. In un primo esperimento di 5 ore e 36 minuti, l’animale, con temperatura corporea intorno ai 32° Réaumur (40 °C), produsse circa 7 once di ghiaccio fuso (fr:1849-1850). Un secondo esperimento, della durata di 10 ore e 36 minuti, diede 14 once e 5 gros di acqua (fr:1851). L’animale “did not appear to suffer at all” – (fr:1852) [non sembrò soffrire affatto.] Normalizzando a 10 ore, la media dei due saggi è di 13 once, 1 gros e circa 13 grani di ghiaccio fuso (fr:1853). Questo dato rappresenta la quantità di calore che l’organismo disperde e deve continuamente rigenerare: “the animal’s vital functions continually restore to it the heat which it gives off to its environment” – (fr:1924) [le funzioni vitali dell’animale gli restituiscono continuamente il calore che cede all’ambiente.]

L’analisi chimica della respirazione si svolge in parallelo. Una cavia introdotta in una campana contenente 248,01 pollici cubici di aria dephlogisticated vi rimane per un’ora e un quarto: dopo raffreddamento e assorbimento dell’aria fissa, restano 200,56 pollici cubici di aria, da cui si deduce che “46.62 inches of pure air had been altered, and 96 inches of fixed air produced” – (fr:1895) [46,62 pollici cubici di aria pura erano stati alterati, e 37,96 pollici cubici di aria fissa erano stati prodotti.] Il rapporto di riduzione volumetrica tra aria pura consumata e aria fissa prodotta differisce leggermente da quello della combustione del carbonio (0,814 contro 0,74828), discrepanza che viene in parte attribuita all’ingresso di piccole quantità di aria esterna durante l’introduzione dell’animale attraverso il mercurio (fr:1896-1897). Per ottenere misure dirette della produzione di aria fissa in condizioni di aria atmosferica, gli autori allestiscono un sistema a flusso con due flacche contenenti alcali caustico. In tre ore, l’aumento di peso delle flacche è di 71 grani (63+8), proiettando in 10 ore una produzione di 236,667 grani di aria fissa (fr:1905-1906). Viene prestata attenzione a evitare che i vapori acquei espirati falsino la pesata: un tubo curvo immerso nel mercurio condensa l’umidità, “the air entering the first flask contained no appreciable amount of moisture” – (fr:1908) [l’aria che entrava nella prima fiasca non conteneva una quantità apprezzabile di umidità.] Combinando più esperimenti, il valore medio adottato per la produzione di aria fissa dalla cavia in dieci ore è di 224 grani (fr:1912).

Una sezione di notevole rilievo storico è dedicata a confutare le osservazioni di Scheele e Priestley. La loro conclusione che la respirazione producesse poca aria fissa e molta aria “phlogisticated” (flogisticata, cioè azoto) viene respinta: “we have constantly observed that the transformation of this air into fixed air is the main alteration produced by the respiration of animals” – (fr:1916) [abbiamo costantemente osservato che la trasformazione di quest’aria in aria fissa è la principale alterazione prodotta dalla respirazione degli animali.] Facendo respirare a più riprese la stessa aria a cavie e poi a uccelli, intervallando assorbimenti con alcali, gli autori riescono a convertire quasi interamente l’aria pura in aria fissa, dimostrando che altre alterazioni “are inconsiderable” – (fr:1918) [sono trascurabili].

La sintesi finale quantifica l’equivalenza termica della respirazione. Poiché la formazione di un’oncia di aria fissa scioglie 26,692 once di ghiaccio, la produzione di 224 grani di aria fissa in 10 ore deve corrispondere al calore necessario per fondere 10,38 once di ghiaccio (fr:1919-1920). Mettendo a confronto questo valore calcolato con i 13 once misurati direttamente nel calorimetro, gli autori introducono correzioni fisiologiche: l’animale nel calorimetro ha le estremità raffreddate e una parte del ghiaccio è sciolta dall’umidità corporea che condensa e cede calore. “On subtracting about 2½ ounces from this quantity of ice, one obtains the amount melted by the effect of the respiration of the animal upon the air” – (fr:1927) [Sottraendo circa 2 once e mezza da questa quantità di ghiaccio, si ottiene la quantità fusa per effetto della respirazione dell’animale sull’aria.] Il calore misurato e quello calcolato sulla base dello scambio gassoso convergono così in modo soddisfacente, chiudendo il cerchio tra respirazione e combustione. L’intero impianto concettuale è sorretto da un’ipotesi che gli autori avanzano con la consapevolezza delle sue implicazioni: “M. Lavoisier, having observed these phenomena, suspected that the heat and light liberated in combustion are due… to changes which the pure air undergoes” – (fr:1858) [Il Sig. Lavoisier, avendo osservato questi fenomeni, sospettò che il calore e la luce liberati nella combustione siano dovuti… a cambiamenti che l’aria pura subisce.] L’attacco quantitativo al problema del calore animale non è solo un esperimento riuscito, ma la dimostrazione che i confini tra chimica inanimata e fisiologia sono dissolti.

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10 Il deuterio come tracciante metabolico: la scoperta del deposito intermedio dei grassi

Un resoconto degli esperimenti pionieristici che, impiegando acidi grassi marcati con deuterio, rivelarono che il grasso alimentare viene in gran parte depositato nei tessuti di riserva prima di essere ossidato, ponendo le basi per l’uso degli isotopi stabili in biochimica.

Le ricerche descritte si collocano agli albori dell’impiego degli isotopi stabili come traccianti in fisiologia, affrontando con consapevolezza sia le potenzialità sia i limiti della metodologia. Gli autori riconoscono che la perdita di deuterio durante le trasformazioni metaboliche rappresenta un fattore da considerare: se da un lato “if the conversion of one substance into another is to be investigated, the deuterium […] may be lost in the metabolic process” – (fr:2068) [se si deve indagare la conversione di una sostanza in un’altra, il deuterio può essere perso nel processo metabolico], dall’altro “a partial loss, which has to be expected, would certainly not invalidate such experiments” – (fr:2070) [una perdita parziale, che è da aspettarsi, non invaliderebbe certamente tali esperimenti]. Il fondamento analitico si basa sul comportamento dell’acqua pesante nell’organismo: poiché il rene e gli altri organi escretori non concentrano l’acqua pesante, “the deuterium will be equally distributed in all fluids” – (fr:2073) [il deuterio sarà ugualmente distribuito in tutti i fluidi]. Di conseguenza, la determinazione del deuterio nei liquidi corporei consente di valutare quanta parte della sostanza somministrata sia stata bruciata o abbia reso labile il marcatore, fornendo “very valuable clues” – (fr:2075) [indizi molto preziosi]. Il metodo viene inoltre proposto come indicatore universale per seguire la sintesi di materiale organico a partire dall’idrogeno dell’acqua corporea, sulla scorta dell’osservazione di Reitz e Bonhoeffer che alghe verdi cresciute in acqua arricchita con acqua pesante contengono “deuterium atoms which are not exchangeable with water” – (fr:2078) [atomi di deuterio non scambiabili con l’acqua].

Il cuore sperimentale del lavoro riguarda il metabolismo dei grassi. Topi nutriti per diversi giorni con una dieta comprendente un grasso deuterato e mantenuti in condizioni di sottoalimentazione – “a diet which was insufficient in quantity for them to maintain their weight” – (fr:2083) [una dieta insufficiente in quantità per mantenere il loro peso] – hanno prodotto un risultato inatteso. Contrariamente all’aspettativa che quasi tutto il grasso ingerito venisse ossidato, “Much to our surprise we found that, in spite of the fact that the animals had lost weight, a large proportion of the absorbed fat was deposited in the depots” – (fr:2085) [Con nostra grande sorpresa abbiamo trovato che, nonostante gli animali avessero perso peso, una larga proporzione del grasso assorbito era depositata nei depositi]. Ciò indicava che il grasso bruciato non veniva ossidato direttamente dopo l’assorbimento, bensì mobilizzato dai depositi. La prova diretta dell’avvenuta combustione di parte del grasso marcato è fornita dal ritrovamento di quantità apprezzabili di acqua pesante nei fluidi corporei distillati (fr:2086). L’approccio consente di tracciare il destino di minime quantità lipidiche, “which could not be traced by any other method” – (fr:2090) [che non potevano essere tracciate con nessun altro metodo], rendendo possibile analizzare topi alimentati con diete contenenti appena l’1% di grassi marcati (fr:2091).

Il grasso somministrato era un olio di lino parzialmente idrogenato, con caratteristiche simili all’olio d’oliva e un contenuto di deuterio del 74% atomico (fr:2092-2095). La procedura sperimentale prevedeva l’alloggiamento individuale in becher con lana estratta con etere come lettiera, e la somministrazione del cibo in una cupola sospesa. Al termine di ogni periodo di alimentazione, che variava da due a otto giorni, gli animali venivano sacrificati. Il tratto intestinale veniva ricollocato nel becher insieme a cibo sparso e feci, mentre gli organi interni erano analizzati separatamente. L’acqua corporea era ottenuta per sublimazione sotto vuoto: “The carcasses soon froze and ice sublimed into the trap” – (fr:2109) [Le carcasse congelarono presto e il ghiaccio sublimò nella trappola]. L’isolamento degli acidi grassi e del materiale insaponificabile sfruttava la solubilità della materia organica in alcool alcalino caldo (fr:2115), seguita da estrazioni eteree. Nella separazione degli acidi grassi si osservava occasionalmente un precipitato insolubile in etere che si raccoglieva all’interfaccia e veniva compattato prima del drenaggio dell’acqua (fr:2132-2133). Il contenuto in deuterio degli acidi grassi isolati era determinato secondo procedure descritte altrove.

I risultati, raccolti nelle Tabelle I e II, mostrano che nel corso degli esperimenti tutti i topi perdevano una modesta quantità di peso, pur apparendo sani (fr:2173). Nei regimi con il 20% di grassi, la concentrazione di deuterio nei grassi di deposito cresceva progressivamente con la durata dell’esperimento, mentre quella nei grassi degli organi rimaneva inferiore. Negli esperimenti a più basso contenuto lipidico (4% e 1%) la sensibilità analitica permetteva comunque di rilevare l’incorporazione del marcatore. I dati sull’acqua corporea, riportati solo per alcuni gruppi, confermavano la presenza di acqua pesante come prodotto della combustione del grasso marcato.

Nella discussione gli autori sottolineano l’equivalenza fisiologica del grasso deuterato rispetto a un grasso naturale, sia per le proprietà fisiche sia sul piano teorico: “On theoretical grounds we cannot expect that molecules containing more deuterium than usual will be treated in a manner different from those in which the hydrogen is present in its ordinary isotopic ratio” – (fr:2167) [Su basi teoriche non possiamo aspettarci che molecole contenenti più deuterio del solito siano trattate in modo diverso da quelle in cui l’idrogeno è presente nel suo rapporto isotopico ordinario]. Manifestano quindi piena fiducia che i risultati indichino la via seguita dai composti naturali nell’organismo (fr:2168). Pur riconoscendo che i dati non sono completi perché alcuni metodi analitici furono messi a punto durante la ricerca stessa, rivendicano l’ampia applicabilità del metodo, capace di seguire il destino del grasso anche in un animale piccolo come il topo e a livelli alimentari dell’1% (fr:2171). L’osservazione che in tutti gli esperimenti una larga parte del grasso alimentare veniva ritrovata nei depositi – definiti come il grasso totale dell’animale meno quello degli organi interni (fr:2177) – solleva infine il problema centrale: “as to whether all the fat, after absorption, is deposited in the depots before it is oxidized” – (fr:2178) [se tutto il grasso, dopo l’assorbimento, sia depositato nei depositi prima di essere ossidato]. Questa domanda, formulata a partire da dati ottenuti con una metodologia completamente nuova, costituisce il contributo storico più rilevante del testo, anticipando il concetto di un turnover dinamico dei lipidi di riserva che sarebbe stato pienamente sviluppato negli anni successivi.

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11 I “piccoli animaletti” dell’infuso di pepe: la nascita della microbiologia nelle lettere di Leeuwenhoek

Nelle sue lettere alla Royal Society, l’olandese Antoni van Leeuwenhoek riferisce osservazioni compiute con microscopi da lui costruiti, descrivendo una miriade di esseri viventi invisibili a occhio nudo. Il brano riporta due serie di esperienze: dapprima l’esame di acque stagnanti, poi lo studio sistematico di un infuso di pepe intero in acqua di neve.

L’autore aveva già osservato in acqua piovana piccole creature che, quando urtavano un filamento, restavano impigliate: «I hesc little creatures, if they chanced to light upon the least filament or string, or other such particle, of which there are many in water, especially after it hath stood some days, they stook intangled therein, extending their body in a long round, and striving to dis-intarigle their tayl; whereby It came to pass, that their whole body lept back towards the globul of the tayl, which then rolled together Serpetit-iike, and after the [107] manner of Copper- or Iron-wire that having been wound about a stick, and unwound again, retai;)s those windings and turnings.» – (fr:2236) [Se queste piccole creature si imbattevano nel benché minimo filamento o cordicella, di cui ve ne sono molte nell’acqua, specialmente dopo alcuni giorni, vi restavano impigliate, estendendo il corpo in un lungo cilindro e sforzandosi di liberare la coda; con la conseguenza che l’intero corpo scattava all’indietro verso il globulo della coda, la quale si arrotolava come un serpente, alla maniera del filo di rame o di ferro che, avvolto attorno a un bastoncino e poi srotolato, conserva quelle spire]. Questo movimento di estensione e contrazione proseguiva a lungo (fr. 2237). Tra quelle minute forme di vita riconobbe diverse tipologie. Una seconda sorta era di figura ovale, con la testa all’estremità appuntita (fr. 2238-2239); la parte inferiore, piatta, era fornita di «incredibly thin feet» che si muovevano agilmente e che egli riuscì a distinguere solo dopo molte osservazioni (fr. 2240). La parte superiore del corpo era tondeggiante e conteneva 8, 10 o 12 globuli molto chiari (fr. 2241). Questi animaletti, se posti su una superficie asciutta, assumevano una forma perfettamente sferica e spesso scoppiavano: «changing themselves itito a round, their body was raised pyramidal-wise with an extant point in the middle, and having lain thus a little while with a motion of their feet, they burst asunder, and the globuls were pre.sently diffus’d and dis.sipated, so that I could not discern the least thing of any film, in which the globuls had doubtless been inclosed» – (fr:2244) [cambiandosi in una sfera, il corpo si sollevava a piramide con una punta sporgente al centro e, dopo esser rimasto così per un po’ muovendo i piedi, scoppiava, e i globuli si diffondevano e disperdevano subito, senza che io potessi scorgere la minima traccia di una membrana che li avesse racchiusi]. Durante lo scoppio riusciva a contare più globuli che nell’animale vivo.

Una terza sorta era lunga il doppio della larghezza e, ai suoi occhi, otto volte più piccola della prima (fr. 2245); con tutto ciò egli credeva di scorgere piedini grazie ai quali si muovevano rapidamente in linea retta o circolare (fr. 2246). Una quarta sorta era talmente minuscola da non potervi attribuire alcuna forma (fr. 2247). Leeuwenhoek tentò un confronto dimensionale: «These were a thousand times smaller than the eye of a big Louse: For I judge, the axis of the eye of such a Louse to be more than ten times as long as the axis of any of the said little creatures» – (fr:2248) [Erano mille volte più piccoli dell’occhio di un grosso pidocchio: giudico infatti che l’asse dell’occhio di un tale pidocchio sia più di dieci volte più lungo dell’asse di una qualsiasi di queste piccole creature]. Queste ultime superavano tutte le altre in velocità, e spesso restavano ferme su un punto ruotando con la rapidità di una trottola, tracciando una circonferenza non più grande di un granello di sabbia, per poi estendersi in avanti e infine assumere una posizione curva (fr. 2249-2250).

La seconda parte del testo è dedicata a un esperimento condotto con pepe in infusione. Il 24 aprile 1676, dopo aver lasciato macerare per circa tre settimane un’oncia di pepe intero in acqua, aggiungendo anche acqua di neve, l’osservatore scrutò il liquido e vi scorse «an incredible number of little animals of divers kinds» (fr. 2255). Tra questi, alcuni erano 3 o 4 volte più lunghi che larghi, con uno spessore che non superava, a suo giudizio, quello di un capello di pidocchio (fr. 2255). Quando lasciava defluire l’acqua, ruotavano come trottole, il corpo dapprima ovale poi tornava alla forma allungata (fr. 2256). Una seconda sorta, di figura perfettamente ovale, si muoveva con non minore agilità ed era assai più numerosa (fr. 2257). La terza sorta, ancora più abbondante, possedeva code simili a quelle già viste nell’acqua piovana (fr. 2258). La quarta era incredibilmente piccola: «I judged, that if too of them lay one by another, they would not equal the length of a grain of course Sand; and according to this estimate, ten hundred thousand of them could not equal the dimensions of a grain of such course Sand.» – (fr:2259) [giudicai che se cento di loro fossero stati disposti uno accanto all’altro, non avrebbero eguagliato la lunghezza di un granello di sabbia grossolana; e di conseguenza, un milione di essi non avrebbe potuto eguagliare le dimensioni di un tale granello]. Una quinta sorta aveva quasi lo stesso spessore della precedente ma era lunga il doppio (fr. 2260).

Leeuwenhoek allestì anche un’osservazione di controllo. Il 26 aprile prese due once e mezzo di acqua di neve vecchia di tre anni, conservata in una bottiglia di vetro ben tappata; in essa non trovò alcuna creatura vivente (fr. 2262). La versò in una tazza di porcellana con mezza oncia di pepe e la tenne nel suo studio (fr. 2263). Fino al 4 maggio non vide mai nulla di vivo (fr. 2264). Dopo aver rabboccato con altra acqua di neve, «the sixth, I did very MICROBIOLOGY many, and those exceeding small ones, whose body seem’d to me twice as long as broad, but they moved very slowly and often round ways» – (fr:2266) [il sei [maggio] ne vidi moltissimi, ed erano piccolissimi, con corpo circa due volte più lungo che largo, e si muovevano molto lentamente e spesso in percorsi circolari]; il giorno seguente erano già assai più abbondanti (fr. 2267). Continuando ad aggiungere acqua man mano che evaporava, il 24 maggio scoprì un ulteriore tipo, perfettamente ovale, simile a uova di cuculo, con il capo all’estremità appuntita e all’interno 10-14 globuli separati l’uno dall’altro (fr. 2270-2271). Anche questi, se posti all’asciutto, «changed their body into a perfect round, and often burst asunder, & the globuls, together with some aqueous particles, spred themselves every where about, without my being able to discern any other remains» – (fr:2272) [cambiavano il corpo in una sfera perfetta e spesso scoppiavano, e i globuli, insieme con alcune particelle acquose, si spargevano dappertutto senza che io potessi scorgere alcun altro residuo]; i globuli dispersi avevano all’incirca la grandezza delle primissime e minutissime creature osservate (fr. 2273).

Il resoconto colpisce per la precisione descrittiva e per la gerarchia di grandezze stabilita attraverso confronti empirici (occhio di pidocchio, granello di sabbia, capello). L’uso di un infuso di pepe come mezzo di coltura e l’attenzione alla comparsa progressiva di forme sempre più numerose costituiscono una delle prime testimonianze di esperimenti quantitativi sui microrganismi. Il testo documenta la nascita dell’osservazione microbiologica, in un momento – il 1676 – in cui il mondo invisibile cominciava a rivelarsi all’occhio umano. L’assenza di vita nell’acqua di neve sigillata e la successiva proliferazione dopo l’aggiunta del pepe suggerivano che gli animaletti provenissero dal pepe stesso o dall’aria, mettendo in discussione l’idea della generazione spontanea e aprendo la strada agli studi di microbiologia.

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[12.1/1-49-2499|2546]

12 La costanza delle specie batteriche patogene e il metodo di Koch

Dalla specificità dei germi alla necessità di distinguere specie distinte: il corpo animale come mezzo di coltura pura e la nascita dei postulati.

Koch osserva che, sebbene forme batteriche riscontrate negli animali possano avere un ruolo anche in malattie dell’uomo (2499), una stessa specie batterica – come il bacillo della setticemia – non è inoculabile in ogni varietà animale, cosicché setticemie di topo, coniglio e uomo non sono sempre prodotte dallo stesso microrganismo (2498). Di conseguenza, occorre dimostrare caso per caso la presenza di batteri, i quali possono essere simili per forma, dimensioni e condizioni di crescita, ma non sempre identici anche in malattie apparentemente simili di animali diversi (2501). Proprio questa esigenza di prova è alla base di quelle condizioni che – come annotano i curatori – «These conditions, since known as Koch’s postulates, have become the ground rules for medical microbiology» – (fr:2500) [Queste condizioni, da allora note come postulati di Koch, sono diventate le regole fondamentali della microbiologia medica].

Dai suoi esperimenti, condotti soltanto su malattie a esito fatale e su un numero ancora limitato di forme (2503‑2504), Koch ricava un fatto che considera il risultato più importante del proprio lavoro: «one fact was so prominent that I must regard it as constant, and, as it helps to remove most of the obstacles to the admission of the existence of a contagium vivum for traumatic infective diseases, I look on it as the most important result of my work» – (fr:2506) [un fatto era così evidente che devo considerarlo costante, e poiché aiuta a rimuovere la maggior parte degli ostacoli all’ammissione dell’esistenza di un contagium vivum per le malattie infettive traumatiche, lo ritengo il risultato più importante del mio lavoro]. Tale fatto è «the differences which exist between pathogenic bacteria and to the constancy of their characters» – (fr:2507) [le differenze che esistono tra i batteri patogeni e la costanza dei loro caratteri]. A ogni malattia corrisponde una forma batterica distinta, che rimane la stessa per quanto spesso la malattia venga trasmessa da un animale all’altro (2508); quando la stessa malattia è riprodotta de novo iniettando sostanze putride, compare soltanto la forma batterica già riconosciuta come specifica (2509).

Le differenze tra questi batteri sono tanto grandi quanto ci si può attendere per particelle che rasentano l’invisibile, e riguardano non solo dimensioni e forma ma anche le condizioni di crescita, riconoscibili dalla disposizione e dall’aggruppamento (2510‑2511). Koch studia perciò l’intero gruppo: «I would, for example, consider a micrococcus which in one species of animal occurred only in masses (i. e., in a zooglasa form), as different from another which in the same variety of animal, under the same conditions of life, was only met with as isolated individuals» – (fr:2512‑2513) [considererei, per esempio, un micrococco che in una specie animale si presenti solo in masse (ossia in forma di zooglea) come diverso da un altro che nello stesso tipo di animale, nelle stesse condizioni di vita, si incontri soltanto come individui isolati]. Altrettanto eloquente è l’effetto fisiologico: il caso del bacillo e del micrococco a catenella che crescono insieme nel tessuto cellulare dell’orecchio, il primo capace di passare nel sangue e penetrare nei globuli bianchi, il secondo di diffondersi lentamente nei tessuti distruggendo tutto intorno; oppure i micrococchi setticemico e piemico del coniglio con il loro diverso rapporto con il sangue; o ancora i bacilli che nell’erisipela rimangono sulla superficie della cartilagine auricolare mentre il Bacillus anthracis, inoculato anch’esso nell’orecchio del coniglio, invade rapidamente il sangue (2514). Poiché a ogni malattia studiata corrisponde una forma batterica caratterizzata in modo distinto per azione fisiologica, condizioni di crescita, dimensioni e forma, forma che non si trasforma mai in un’altra, occorre considerare queste diverse forme come specie distinte e costanti (2515).

Koch è consapevole che una simile affermazione sarà contestata dai botanici, a cui la materia appartiene per competenza (2516). Cita Nägeli, il quale in dieci anni di esame su migliaia di forme non ha mai visto la necessità di dividerle nemmeno in due specie (2517), e Brefeld, che ammette specie solo quando l’intera storia dello sviluppo sia stata tracciata mediante coltivazione da spora a spora nei liquidi più nutritivi (2518). Pur giudicando teoricamente corretta la richiesta di Brefeld, Koch non la ritiene una conditio sine qua non per ogni ricerca sui batteri patogeni (2519): altrimenti si dovrebbero sospendere le indagini eziologiche fino a quando i botanici non avessero classificato tutte le specie, col rischio di sprecare un enorme lavoro di coltura pura su forme di nessun interesse (2520‑2521). «In practice only the opposite method can work.» – (fr:2522) [In pratica solo il metodo opposto può funzionare.] Dapprima si riconoscono le peculiarità di una forma e la sua costanza, separandola provvisoriamente come specie; poi, per verificare l’ipotesi, si può intraprendere la coltivazione da spora a spora (2523‑2524). Se questa riesce, eliminando ogni fonte di errore, e fornisce un risultato coerente con le osservazioni precedenti, allora la conclusione di trovarsi di fronte a una specie distinta è valida (2525). Koch dichiara di attenersi a questo metodo, l’unico pratico corretto, finché la coltivazione non dimostri il contrario (2526).

Per mostrare di non essere isolato, richiama le opinioni di Cohn, che continua a separare batteri di forma e potere fermentativo diverso fino a prova contraria della loro identità (2527‑2528), e di Eidam, il quale dalle indagini su Bacterium termo ha concluso che forme differenti richiedono condizioni nutritive diverse e reagiscono diversamente a influenze fisiche e chimiche, offrendo così un’ulteriore prova della necessità di suddividere gli organismi in specie distinte (2529‑2530).

Un ulteriore argomento a favore delle specie risiede nel valore attribuito alle colture pure, in cui è presente una sola forma batterica: se in una serie di colture si ottiene sempre la stessa forma, ciò le conferisce il significato di una forma costante, cioè di una specie (2531‑2533). Ma è possibile condurre colture pure senza mescolanze? Sì, ma solo in condizioni molto limitate. Con gli strumenti disponibili si possono coltivare in purezza solo batteri riconoscibili per dimensioni e forma, come il Bacillus anthracis, o per produzione di pigmento, come i batteri cromogeni (2534‑2536). Se durante una serie di colture si introduce accidentalmente una specie estranea, la si nota subito e l’esperimento viene scartato (2537). Il caso cambia radicalmente con batteri molto piccoli, spesso impossibili da distinguere senza colorazione: allora è impossibile scoprire una contaminazione, e tutte le colture pure in apparecchio, per quanto ingegnose, sono soggette a fonti di errore ineliminabili e di per sé non conclusive (2538‑2539). Tuttavia una coltura pura è possibile anche per i batteri più minuti: «This, however, is not conducted in cultivation apparatus, but in the animal body.» – (fr:2541) [Ciò, tuttavia, non si realizza in apparecchi di coltura, ma nel corpo animale.] Gli esperimenti di Koch lo dimostrano: in tutti i casi di una malattia distinta, come la setticemia dei topi, si ritrovavano solo i piccoli bacilli e mai nessun’altra forma batterica, a meno che non fosse stata inoculata intenzionalmente insieme quella responsabile della gangrena tissutale (2542‑2544). Il corpo animale è il miglior apparecchio di coltura per i batteri patogeni, perché solo un numero molto limitato di batteri può crescervi e la penetrazione di altri microrganismi è così difficile che l’organismo vivente integro può essere considerato completamente isolato rispetto a forme batteriche diverse da quelle introdotte deliberatamente (2545‑2546).

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[13.1/1-88-2627|2713]

13 Dalla casualità alla rivoluzione antibiotica: la testimonianza di Fleming

“Chance favors the prepared mind.” – La scoperta della penicillina non fu un colpo di fortuna isolato, ma il frutto di decenni di osservazioni e dell’incontro decisivo con la chimica.

Il testo, tratto da un trattato scientifico e dall’articolo originale di Alexander Fleming, offre una riflessione storico-critica e la cronaca diretta di una delle più grandi innovazioni della medicina. Si apre con una citazione di Pasteur: “Chance favors the prepared mind.” (fr:2627) [Il caso favorisce la mente preparata]. Tuttavia, viene subito chiarito che il semplice racconto aneddotico della scoperta è fuorviante: “But, though the story is true, its isolated recital conveys a totally erroneous conception of the manner in which chance discoveries become incorporated into the historical stream of scientific knowledge.” (fr:2626) [Ma, sebbene la storia sia vera, il suo racconto isolato trasmette una concezione del tutto errata del modo in cui le scoperte casuali entrano nel flusso storico della conoscenza scientifica]. L’acume del singolo osservatore, per quanto brillante, non basta se il terreno non è stato preparato dal progresso generale della conoscenza (fr:2628). Fenomeni di inibizione tra microrganismi erano già stati documentati per oltre cinquant’anni: Tyndall nel 1876 descrisse l’antagonismo di una specie di Penicillium verso i batteri (fr:2630), Gosio nel 1896 isolò il primo antibiotico cristallino (fr:2631) e all’inizio del Novecento preparati antibiotici grezzi ebbero persino una breve e deludente applicazione terapeutica (fr:2632). La domanda cruciale è quindi: “Why, then, was it only after Fleming’s discovery of penicillin that antibiotics became a practicality?” (fr:2633) [Perché, allora, solo dopo la scoperta della penicillina da parte di Fleming gli antibiotici divennero una realtà pratica?]. La risposta, secondo Florey, è che i pionieri non avevano condotto le indagini chimiche necessarie per separare e purificare i principi attivi (fr:2634); negli anni Trenta, al contrario, la microbiologia si era fortemente orientata alla chimica e fu proprio questo approccio a culminare nella preparazione della penicillina solida da parte di Chain, Florey e collaboratori nel 1940, inaugurando l’attuale arsenale di armi antinfettive (fr:2635).

La testimonianza diretta di Fleming, introdotta dal riferimento di pagina [128], descrive l’osservazione iniziale con precisione: “[128] While working with staphylococcus variants a number of culture-plates were set aside on the laboratory bench and examined from time to time. In the examinations these plates were necessarily exposed to the air and they became contaminated with various micro-organisms. It was noticed that around a large colony of a contaminating mould the staphylococcus colonies became transparent and were obviously undergoing lysis.” (fr:2636-2638) [Mentre lavoravo con varianti di stafilococco, alcune piastre di coltura venivano messe da parte sul banco del laboratorio ed esaminate di tanto in tanto. Durante gli esami, le piastre erano necessariamente esposte all’aria e si contaminavano con vari microrganismi. Si notò che intorno a una grande colonia di una muffa contaminante, le colonie di stafilococco diventavano trasparenti e stavano chiaramente andando incontro a lisi]. Da qui partirono sottocolture della muffa ed esperimenti per caratterizzare la sostanza batteriolitica diffusasi nel terreno (fr:2639); il brodo di coltura mantenuto a temperatura ambiente per una o due settimane aveva acquisito spiccate proprietà inibitorie, battericide e batteriolitiche contro molti patogeni comuni (fr:2640).

La muffa viene descritta morfologicamente: colonia inizialmente bianca e soffice che rapidamente sporula, virando al verde scuro al centro e poi quasi al nero (fr:2641); dopo quattro o cinque giorni compare un pigmento giallo brillante che diffonde nel terreno (fr:2642), talvolta accompagnato da una colorazione rossastra (fr:2643). In brodo cresce in superficie formando una massa feltrosa verde scuro, mentre il brodo diventa giallo brillante e il pigmento non viene estratto dal cloroformio (fr:2644-2645). Il pH del brodo sale a 8,5–9 (fr:2646); si produce acido in tre o quattro giorni in brodo con glucosio o saccarosio, ma non in sette giorni con lattosio, mannite o dulcite (fr:2647-2648). La crescita è lenta a 37°C, più rapida intorno a 20°C e assente in condizioni anaerobiche (fr:2649-2651). Fleming identifica il microrganismo come un Penicillium e nota che per tutti i caratteri rassomiglia molto a P. rubrum, specie che Biourge definiva “animal de laboratoire”, mai trovata in natura ma non rara nell’aria del laboratorio (fr:2652-2654).

Per verificare se la sostanza antibatterica fosse prodotta da tutte le muffe, Fleming saggia otto ceppi diversi (Eidamia viridescens, Botrytis cinerea, Aspergillus fumigatus, Sporotrichum, Cladosporium e diversi Penicillium); solo un ceppo di Penicillium, identico a quello della piastra contaminata, mostrava attività inibitoria (fr:2657-2659). “It is clear, therefore, that the production of this antibacterial substance is not common to all moulds or to all types of penicillium.” (fr:2660) [È chiaro, quindi, che la produzione di questa sostanza antibatterica non è comune a tutte le muffe né a tutti i tipi di Penicillium]. Per comodità, l’autore introduce il termine “penicillina” per designare il filtrato di brodo di coltura del particolare Penicillium in esame (fr:2661-2662).

Il metodo di saggio è ingegnoso: si pratica un solco in una piastra di agar, lo si riempie con una miscela di agar e brodo di muffa, poi si strisciano i microbi perpendicolarmente al solco (fr:2663-2664). La sostanza diffusibile agisce rapidamente: prima che i microbi mostrino crescita visibile, si è diffusa per un centimetro o più a concentrazione sufficiente per inibire i batteri sensibili (fr:2665); prolungando l’incubazione, la porzione prossimale della coltura diventa trasparente e quasi tutti i microbi risultano dissolti, dimostrando l’effetto batteriolitico prolungato (fr:2666). Questo metodo semplice svela sia le proprietà batterio-inibitorie sia quelle batteriolitiche, fornendo una misura della sensibilità del microbo testato tramite l’estensione dell’area di inibizione (fr:2667).

Le proprietà della sostanza antibatterica, dettagliate a partire da pagina [129], includono la resistenza al calore: un’ora a 56°C o 80°C non ha effetto sull’attività antibatterica della penicillina (fr:2668); l’ebollizione di pochi minuti la danneggia appena (fr:2669), mentre un’ora di ebollizione riduce il potere a meno di un quarto se il brodo è alcalino, ma la riduzione è molto minore a pH neutro o leggermente acido (fr:2670). L’autoclavatura a 115°C per 20 minuti la distrugge quasi completamente (fr:2671). La filtrazione attraverso filtro Seitz non diminuisce l’attività e costituisce il metodo migliore per ottenere brodo di muffa sterile attivo (fr:2672-2673). La penicillina è liberamente solubile in acqua e soluzioni saline diluite; evaporata a bassa temperatura fino a ottenere una massa appiccicosa, il principio attivo può essere estratto completamente con alcol assoluto, ma è insolubile in etere o cloroformio (fr:2674-2676).

La cinetica di produzione dell’attività viene seguita seminando spore in 200 ml di brodo a temperatura ambiente (10–20°C). Inibizione completa dello stafilococco a diluizione 1:20 dopo 5 giorni, 1:40 dopo 6 giorni, 1:200 dopo 8 giorni, 1:500 dopo 9 giorni (fr:2677-2679). A 20°C lo sviluppo è più rapido e un buon campione può inibire completamente a diluizioni di 1:500 o 1:800 in 6–7 giorni (fr:2680). Tuttavia, con l’invecchiamento della coltura e con la conservazione a temperatura ambiente, il potere antibatterico decade: a 20°C può quasi scomparire dopo 14 giorni (fr:2681). La stabilità alla conservazione è documentata nella Tabella I (fr:2684-2700), intitolata “Table I.—Effect of Keeping at Room Temperature on the AntiStaphylococcal Power of Penicillin.” (fr:2684) [Tabella I.—Effetto della conservazione a temperatura ambiente sul potere antistafilococcico della penicillina]. Al momento della filtrazione, si osserva inibizione fino a una diluizione di 1/300, mentre dopo 4 giorni l’attività cala (crescita ancora assente a 1/80), dopo 13 giorni è ridotta (crescita a 1/20) e dopo 15 giorni la penicillina è pressoché inattiva. In una nota successiva, a pagina [130], si rimarca che portando il pH da 9 a 6,8 la stabilità aumenta considerevolmente (fr:2700).

Interessanti dettagli aggiuntivi: le goccioline di fluido giallo brillante che si raccolgono sulla superficie della muffa possono raggiungere titoli elevatissimi; un campione di tale fluido inibiva completamente la crescita degli stafilococchi a una diluizione di 1:20.000, mentre il brodo della stessa coltura, testato simultaneamente, inibiva a 1:800 (fr:2701-2702). Inoltre, se la muffa viene coltivata su terreno solido e la massa feltrosa viene staccata ed estratta in soluzione fisiologica, l’estratto mostra proprietà batteriolitiche: mescolato con una densa sospensione di stafilococchi e incubato per 2 ore a 45°C, la torbidità si riduce marcatamente e dopo 24 ore la sospensione diventa quasi limpida (fr:2703-2704). Il brodo nutriente si rivela il terreno più adatto per la produzione di penicillina; l’aggiunta di glucosio o saccarosio, fermentati con produzione di acido, ritarda o impedisce la comparsa della sostanza antibatterica, mentre la diluizione del brodo con acqua ne riduce la produzione e la concentrazione finale (fr:2705-2707).

L’ultima sezione indaga la rapidità di azione della penicillina sullo stafilococco. A differenza di agenti rapidissimi come gli ipocloriti o di sostanze lente come la flavina, la penicillina mostra un’attività intermedia (fr:2708). L’esperimento prevede l’aggiunta di un inoculo di stafilococco a diluizioni di penicillina in brodo, con prelievi a intervalli per la conta su piastra. I dati (fr:2710-2713) indicano che dopo 2 ore il numero di colonie era ancora elevato (27 colonie prima dell’inoculo, 116 dopo 2 ore), ma a 4 ore e mezza e a 8 ore il numero si riduce drasticamente, confermando un’azione battericida tempo-dipendente.

Il testo costituisce una testimonianza storica di prim’ordine: mostra come Fleming abbia condotto un’indagine sistematica, definendo la natura della muffa, coniando il termine “penicillina”, mettendo a punto saggi semplici ma efficaci e caratterizzando le proprietà chimico-fisiche e biologiche della sostanza. Al tempo stesso, la cornice critica iniziale chiarisce che senza la successiva svolta chimica degli anni Trenta, la sua scoperta sarebbe rimasta un’osservazione di laboratorio, per quanto eccezionale, priva di ricadute cliniche.

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14 Il principio trasformante: l’isolamento del DNA come agente dell’ereditarietà

La dimostrazione che un acido nucleico purificato è in grado di indurre una mutazione specifica ed ereditabile nei pneumococchi, collegando chimica, genetica e microbiologia in un unico quadro sperimentale.

Lo studio si colloca in un crocevia disciplinare, all’intersezione tra genetica, chimica e microbiologia, e affronta un problema fondamentale: la possibilità di indurre cambiamenti ereditari prevedibili attraverso mezzi chimici. L’indagine, descritta come il primo caso di trasformazione in vitro capace di indurre una mutazione specifica, rappresenta il culmine di un percorso storico che affonda le sue radici nell’insistenza di Koch sulla continuità ereditaria delle specie batteriche, nella percezione di Miescher dell’associazione tra acidi nucleici e riproduzione cellulare, e nel lavoro dei pionieri della genetica che localizzarono il gene nella cromatina del nucleo: “Its scientific roots go back to Koch’s insistence on the hereditary continuity of bacterial species, to Miescher’s perception that nucleic acids are associated with cellular reproduction, and to the work of the pioneers of genetics who placed the site of the gene in the chromatin substance of the nucleus.” - (fr:2800) [Le sue radici scientifiche risalgono all’insistenza di Koch sulla continuità ereditaria delle specie batteriche, alla percezione di Miescher che gli acidi nucleici siano associati alla riproduzione cellulare, e al lavoro dei pionieri della genetica che collocarono la sede del gene nella sostanza cromatinica del nucleo.]

Il fenomeno di riferimento è la trasformazione dei tipi specifici di Pneumococco, descritta originariamente da Griffith nel Griffith era riuscito a trasformare un tipo batterico in un altro all’interno del corpo di un animale inoculato, dimostrando che una variante R (rugosa), attenuata e priva di capsula, derivata dal Pneumococco di Tipo II, poteva essere convertita in cellule S (lisce), completamente incapsulate e virulente, di un tipo eterologo, il Tipo III. Il risultato cruciale fu che il sangue cardiaco degli animali infettati restituiva pneumococchi di Tipo III in coltura pura, provando che le forme R avevano acquisito ex novo la struttura capsulare e la specificità biologica del Tipo III: “The fact that the R strain was avirulent and incapable by itself of causing fatal bacteremia and the additional fact that the heated suspension of Type III cells contained no viable organisms brought convincing evidence that the R forms growing under these conditions had newly acquired the capsular structure and biological specificity of Type III pneumococci.” - (fr:2811) [Il fatto che il ceppo R fosse avirulento e incapace da solo di causare batteriemia fatale, e il fatto aggiuntivo che la sospensione riscaldata di cellule di Tipo III non contenesse organismi vitali, portò la prova convincente che le forme R cresciute in queste condizioni avevano acquisito ex novo la struttura capsulare e la specificità biologica dei pneumococchi di Tipo III.]

Il passo successivo fu compiuto da Dawson e Sia, che riuscirono a indurre la trasformazione in vitro, facendo crescere cellule R in un mezzo fluido contenente siero anti-R e cellule S incapsulate uccise dal calore. Alloway perfezionò ulteriormente il sistema, dimostrando che la trasformazione specifica poteva essere ottenuta usando estratti sterili di cellule S, privati di elementi corpuscolati e detriti cellulari mediante filtrazione Berkefeld, provando così che il materiale trasformante attivo in forma solubile era efficace quanto le cellule intatte.

Il lavoro di Avery e collaboratori si concentrò sull’isolamento e l’identificazione chimica del principio attivo da estratti batterici grezzi, scegliendo come modello la trasformazione di una variante R non incapsulata di Pneumococco di Tipo II in Pneumococco di Tipo III. La preparazione della sostanza trasformante prevedeva la raccolta delle cellule mediante centrifugazione di colture massali di Pneumococco di Tipo III, l’estrazione con soluzione salina contenente desossicolato di sodio e la precipitazione con alcol etilico assoluto. La soluzione veniva poi deproteinizzata, riprecipitata con alcol, disciolta e digerita con un enzima batterico capace di digerire i polisaccaridi, quindi il materiale attivo era separato mediante frazionamento in alcol etilico.

L’analisi chimica elementare mostrò una corrispondenza con le proporzioni teoriche del desossiribonucleato di sodio. Il trattamento enzimatico fornì la prova decisiva: l’attività non veniva persa con tripsina e chimotripsina, né con ribonucleasi, ma veniva distrutta esclusivamente da preparati enzimatici contenenti la depolimerasi per l’acido desossiribonucleico: “The activity was destroyed only by enzyme preparations containing the depolymerase for desoxyribose nucleic acid.” - (fr:2839) [L’attività veniva distrutta solo da preparati enzimatici contenenti la depolimerasi per l’acido desossiribonucleico.]

La caratterizzazione fisico-chimica confermò la purezza e la natura del materiale. L’esame all’ultracentrifuga analitica indicò che la sostanza era omogenea, con molecole uniformi per dimensione e molto asimmetriche. L’elettroforesi nell’apparato di Tiselius rivelò un solo componente elettroforetico ad alta mobilità, paragonabile a quella di un acido nucleico, e l’attività trasformante risultò associata proprio a questo componente. Le curve di assorbimento ultravioletto mostravano massimi nella regione di 2600 Å e minimi nella regione di 2350 Å, caratteristiche tipiche degli acidi nucleici: “Ultraviolet absorption curves showed maxima in the region of 2600 A and minima in the region of 2350 A. These findings are characteristic of nucleic acids.” - (fr:2845-2846) [Le curve di assorbimento ultravioletto mostravano massimi nella regione di 2600 Å e minimi nella regione di 2350 Å. Questi reperti sono caratteristici degli acidi nucleici.]

La potenza del materiale purificato era straordinaria: esso era capace di indurre la trasformazione in quantità variabili da 0,02 a 0,003 microgrammi, il che rappresenta una concentrazione finale di una parte in 600 milioni.

Sul piano concettuale, lo studio stabilì due distinzioni fondamentali. La prima riguarda la netta separazione chimica tra la sostanza inducente e il prodotto indotto. Il principio trasformante, in base alle sue proprietà chimico-fisiche, appare come una forma altamente polimerizzata e viscosa di desossiribonucleato di sodio, mentre la sostanza capsulare di Tipo III, la cui sintesi è evocata da questo agente, è un polisaccaride non azotato costituito da unità di glucosio-acido glucuronico legate in unione glicosidica: “Equally striking is the fact that the substance evoking the reaction and the capsular substance produced in response to it are chemically distinct, each belonging to a wholly different class of chemical compounds.” - (fr:2856) [Altrettanto sorprendente è il fatto che la sostanza che evoca la reazione e la sostanza capsulare prodotta in risposta ad essa siano chimicamente distinte, appartenendo ciascuna a una classe completamente diversa di composti chimici.]

La seconda distinzione riguarda la specificità biologica. I dati sperimentali suggeriscono fortemente che gli acidi nucleici, almeno quelli del tipo desossiribosio, possiedano specificità differenti, come evidenziato dall’azione selettiva del principio trasformante. Le tecniche impiegate nello studio della trasformazione offrono un mezzo sensibile per verificare questa ipotesi, colmando una lacuna sperimentale preesistente.

Il testo affronta anche i limiti delle tecniche immunologiche per sondare questa specificità. Poiché gli acidi nucleici, liberi o combinati con istoni o protamine, non sono noti per funzionare antigenicamente, non sorprende che preparazioni altamente purificate e prive di proteine mostrassero solo deboli tracce di reazione nei test di precipitazione con sieri antipneumococcici. In assenza di metodi immunochimici speciali, le tecniche di trasformazione restano le uniche disponibili per saggiare differenze nel comportamento biologico degli acidi nucleici: “Unless special immunochemical methods can be devised similar to those so successfully used in demonstrating the serological specificity of simple non-antigenic substances, it appears that the techniques employed in the study of transformation are the only ones available at present for testing possible differences in the biological behavior of nucleic acids.” - (fr:2873) [A meno che non si possano ideare metodi immunochimici speciali simili a quelli usati con tanto successo per dimostrare la specificità sierologica di sostanze semplici non antigeniche, sembra che le tecniche impiegate nello studio della trasformazione siano le uniche attualmente disponibili per saggiare possibili differenze nel comportamento biologico degli acidi nucleici.]

Le osservazioni sul meccanismo rivelano che la trasformazione avviene probabilmente solo durante la riproduzione attiva delle cellule. Le cellule R, come quelle trasformate, contengono un enzima intracellulare che, rilasciato durante l’autolisi, è capace di distruggere rapidamente e completamente l’attività dell’agente trasformante. Le condizioni ottimali si realizzano durante la fase logaritmica di crescita, quando la divisione cellulare è massima e l’autolisi minima.

L’ereditarietà delle modificazioni indotte è un punto centrale. Una volta avvenuta la trasformazione, le nuove caratteristiche sono trasmesse in serie attraverso innumerevoli trasferimenti in terreni artificiali senza ulteriore aggiunta dell’agente trasformante. Dalle cellule trasformate stesse si può recuperare una sostanza di attività identica in quantità di gran lunga superiore a quella originariamente aggiunta. Il principio primario che controlla l’occorrenza e la specificità dello sviluppo capsulare viene quindi reduplicato nelle cellule figlie, e i cambiamenti indotti non sono modificazioni temporanee ma alterazioni permanenti: “The induced changes are not temporary modifications but are permanent alterations which persist provided the cultural conditions are favorable for the maintenance of capsule formation.” - (fr:2886) [I cambiamenti indotti non sono modificazioni temporanee ma alterazioni permanenti che persistono purché le condizioni colturali siano favorevoli al mantenimento della formazione capsulare.]

Le implicazioni genetiche sono affrontate esplicitamente attraverso diverse ipotesi interpretative. L’interpretazione genetica, sostenuta da Dobzhansky, equipara la sostanza inducente a un gene e l’antigene capsulare prodotto in risposta a un prodotto genico: “If this transformation is described as a genetic mutation—and it is difficult to avoid so describing it—we are dealing with authentic cases of induction of specific mutations by specific treatments.” - (fr:2894) [Se questa trasformazione è descritta come una mutazione genetica – ed è difficile evitare di descriverla così – abbiamo a che fare con casi autentici di induzione di mutazioni specifiche mediante trattamenti specifici.] Stanley propone un’analogia con l’attività di un virus, mentre Murphy suggerisce per entrambi il termine “mutageni trasmissibili”.

Con una cautela che riflette il rigore scientifico, gli autori riconoscono la possibilità che l’attività biologica non sia una proprietà inerente all’acido nucleico ma sia dovuta a minime quantità di qualche altra sostanza adsorbita o intimamente associata. Tuttavia, se le evidenze disponibili saranno confermate, gli acidi nucleici di questo tipo dovranno essere considerati non solo strutturalmente importanti ma funzionalmente attivi nel determinare le attività biochimiche e le caratteristiche specifiche delle cellule pneumococciche. Se il principio attivo e il desossiribonucleato di sodio sono la medesima sostanza, allora la trasformazione descritta rappresenta un cambiamento chimicamente indotto e specificamente diretto da un composto chimico noto: “Assuming that the sodium desoxyribonucleate and the active principle are one and the same substance, then the transformation described represents a change that is chemically induced and specifically directed by a known chemical compound.” - (fr:2904) [Ammettendo che il desossiribonucleato di sodio e il principio attivo siano una e la stessa sostanza, allora la trasformazione descritta rappresenta un cambiamento che è chimicamente indotto e specificamente diretto da un composto chimico noto.]

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15 La trasmissione dell’influenza fototropica: dalla “percezione” darwiniana alla natura materiale dello stimolo

Il testo traccia lo sviluppo di un concetto fondamentale nella fisiologia vegetale: la crescita della pianta in risposta alla luce è regolata da un’influenza trasmessa dagli apici in crescita alle regioni inferiori. Il resoconto si apre con la sintesi di una scoperta rivoluzionaria: “I’his rather revolutionary ifincept (irose from numerous observations in a lenqthy series of inr/eniously contrived experi¬ ments with a wide variety of different plants. I’he major findinr/ reported here is that plant r/rowth is eontinrjent upon the produrtion and diljusion of some active material elahorated hy the f/rowinrj tips in plants.” - (fr:2938, 2937) [Questo concetto piuttosto rivoluzionario nacque da numerose osservazioni in una lunga serie di esperimenti ingegnosamente ideati con un’ampia varietà di piante diverse. Il principale risultato qui riportato è che la crescita delle piante dipende dalla produzione e diffusione di un qualche materiale attivo elaborato dagli apici in crescita nelle piante.] Questa idea, che oggi definiremmo ormonale, ebbe origine da semplici ma acute osservazioni sul comportamento delle plantule.

Charles e Francis Darwin, confermando precedenti lavori di Dandolle, notarono che nei cotiledoni di Phalaris canariensis, esposti a luce laterale, la curvatura iniziava sempre dalla parte superiore per poi estendersi gradualmente verso la base. L’osservazione cruciale che li portò a postulare un’influenza trasmessa è descritta vividamente: “LOCAI.ISKO SI5NS/TIV1’,N USS TO LIGHT, ANO ITS TRANSMITTKO KFT HOTS PhaI/Aris canariknsis.—Wliilsf ohservinf; tlie accuracy witli wliich the cotyledons of this plant hecame hent towards the I’n’ht of a small lamp, we were impressed with the idea that the uppermost part determined the direction of the curvature of the lower part.” - (fr:2941) [Localizzazione della sensibilità alla luce e sua trasmissione degli effetti. Phalaris canariensis.—Osservando la precisione con cui i cotiledoni di questa pianta si piegavano verso la luce di una piccola lampada, fummo colpiti dall’idea che la parte più alta determinasse la direzione della curvatura della parte inferiore.]

Questo fenomeno venne analizzato meticolosamente, documentando come la curvatura, inizialmente confinata all’apice, si propagasse verso il basso. Si osservò una dinamica di auto-raddrizzamento: “as soon as the upper convex surface of the bowed down portifjn received more light than the lower concave surface” - (fr:2944) [non appena la superficie convessa superiore della porzione piegata riceveva più luce della superficie concava inferiore], la parte superiore inverteva la sua curvatura, raddrizzandosi. Il risultato finale di questa complessa interazione è illustrato nella figura 181, dove la porzione superiore del cotiledone, inizialmente arcuata verso la luce, diventa quasi perfettamente dritta, mentre la base forma un angolo retto. “I Hii-z/rtm Crinriricnsts: cotylciloim after cxposiirc in a liox open on one side in soutli-W(’«l window dnriiiK H li. (’iirvatnre toward* the li(/ht aienrately traced. liori/.ontal lincH »liow the level of llie grotitid.” - (fr:2949-2951) [Fig. Phalaris canariensis: cotiledoni dopo esposizione in una scatola aperta su un lato in una finestra a sud-ovest durante 8 ore. Curvatura verso la luce tracciata accuratamente. Le linee orizzontali mostrano il livello del terreno.]

Per verificare l’ipotesi che l’apice fosse la sede della percezione e che da lì partisse un segnale, i Darwin condussero una serie di esperimenti di oscuramento e decapitazione. Dimostrarono che coprire gli apici con tubi di vetro annerito impediva la curvatura della parte basale esposta, mentre tubi trasparenti non avevano effetto. “I’he blackened tubes were then removed from 10 of these seedlings, and they were now ex¬ posed before a lamp for 8 h.: 9 of them became greatly, and i moderately, curved towards the light, proving that the previous absence of any curvature in the basal part […] was due to the exclusion of light from the upper part.” - (fr:2989) [I tubi anneriti furono quindi rimossi da 10 di queste plantule, che vennero poi esposte davanti a una lampada per 8 ore: 9 di esse divennero fortemente, e 1 moderatamente, curve verso la luce, provando che la precedente assenza di curvatura nella parte basale era dovuta all’esclusione della luce dalla parte superiore.] Conclusero in modo inequivocabile: “We must therefore conclude that when seed¬ lings are freely exposed to a lateral light some influence is transmitted from the upper to the lower part, causing the latter to bend.” - (fr:2996) [Dobbiamo quindi concludere che quando le plantule sono liberamente esposte a una luce laterale, una qualche influenza viene trasmessa dalla parte superiore a quella inferiore, inducendo quest’ultima a piegarsi.]

Il testo prosegue illustrando il salto concettuale compiuto da P. Boysen-Jensen, che fornì la prima prova definitiva della natura materiale di questa influenza. L’esperimento cruciale è un capolavoro di semplicità: “The crucial experiment involves the demonstration that the influence generated at the tip can pass across a tissue discontinuity. First he cut off the tips of young shoots. The7i, after placing a layer of gelatin on the cut stumps he replaced the tips and exposed the latter to light.” - (fr:3004-3006) [L’esperimento cruciale comporta la dimostrazione che l’influenza generata all’apice può attraversare una discontinuità tissutale. Prima tagliò le punte di giovani germogli. Poi, dopo aver posto uno strato di gelatina sui moncherini, riposizionò le punte ed espose queste ultime alla luce.] La curvatura che ne risultò nella regione basale, al buio, dimostrò che “the influence postulated by Darwin was of a material nature capable of diffusing through a gelatin barrier without impairment” - (fr:3008) [l’influenza postulata da Darwin era di natura materiale, capace di diffondere attraverso una barriera di gelatina senza impedimenti].

La ricerca si concentrò poi sulla via di trasmissione di questo stimolo. Mentre autori come Rothert e Fitting sostenevano una trasmissione attraverso il parenchima e indipendente dalla posizione di incisioni trasversali sul coleottile, Boysen-Jensen ottenne risultati contrastanti. Scoprì che la discrepanza dipendeva dall’umidità atmosferica: “When the seedlings are in a very moist atmosphere, transmission of a stimulus takes place, regardless of the position of the incision in relation to the light; but when the experiments are carried out either in dry air or under water, transmission of the stimulus occurs only when the incision is located on the illuminated side of the coleoptile; it does not take place when the incision is on the shaded side.” - (fr:3025) [Quando le plantule sono in un’atmosfera molto umida, la trasmissione dello stimolo avviene indipendentemente dalla posizione dell’incisione rispetto alla luce; ma quando gli esperimenti sono condotti in aria secca o sott’acqua, la trasmissione dello stimolo si verifica solo quando l’incisione è localizzata sul lato illuminato del coleottile; non avviene quando l’incisione è sul lato ombreggiato.] Approfondendo, dimostrò in modo spettacolare la trasmissione laterale asimmetrica tagliando completamente la punta del coleottile e riposizionandola, con un anello di burro di cacao, su una goccia di gelatina posta sul moncone. Illuminando unilateralmente la punta recisa, ottenne una forte curvatura nella base al buio. Questo lo portò a una certezza: “My assumption became a certainty only when I succeeded in cutting off the tip of the coleoptile entirely, then in replacing it again and evoking a positive phototropic curvature in the darkened base by illuminating one side of the tip.” - (fr:3030) [La mia ipotesi divenne una certezza solo quando riuscii a tagliare via completamente la punta del coleoptile, quindi a riposizionarla ed evocare una curvatura fototropica positiva nella base tenuta al buio illuminando un lato della punta.]

Il percorso scientifico si conclude con un accenno agli sviluppi successivi, in cui il lavoro di Boysen-Jensen fu esteso e raffinato da F. W. Went, il quale osservò che “if the decapitated tip was replaced asymmetrically, the shoot curved so that the side in contact with the displaced tip was convex” - (fr:3044) [se la punta decapitata veniva riposizionata asimmetricamente, il germoglio si curvava in modo che il lato a contatto con la punta spostata diventasse convesso], un esperimento che aprì la strada all’isolamento e all’identificazione chimica dell’auxina, la sostanza che aveva guidato l’invisibile mano della crescita verso la luce.

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16 La scoperta dei regolatori di crescita: un metodo quantitativo per lo studio delle auxine

La diffusione di uno stimolo fototropico attraverso la gelatina conduce all’isolamento di ipotetici regolatori di crescita e alla messa a punto di un saggio biologico quantitativo basato sulla curvatura del coleoptile.

Il testo descrive un momento fondativo della fisiologia vegetale, in cui viene dimostrata la natura chimica dello stimolo di crescita e si sviluppa un metodo per quantificarlo. Il punto di partenza è la conferma che la diffusione di uno stimolo fototropico avviene anche attraverso la gelatina: “Precedenti esperimenti avevano dimostrato che la diffusione di uno stimolo fototropico ha luogo anche attraverso la gelatina.” - (fr:3079). Sfruttando questo principio, l’autore colloca un certo numero di apici di coleoptili di avena sulla gelatina e, dopo circa un’ora, la rimuove e la applica su un lato di piante decapitate. Il risultato è inequivocabile: “Già un’ora dopo queste piante cominciarono a mostrare una curvatura negativa che dopo 4 ore era diventata fortemente negativa, raggiungendo talvolta un angolo di 40° rispetto alla verticale” - (fr:3082). La gelatina non trattata o quella su cui erano stati posti anelli di coleoptile privi dell’apice non producevano curvature significative, provando che la sostanza attiva proveniva specificamente dall’apice. La conclusione è netta: “Era evidente che avevo ottenuto i più o meno ipotetici regolatori di crescita.” - (fr:3083).

L’osservazione successiva trasforma una scoperta qualitativa in un metodo di misura. La curvatura indotta riflette la differenza nel tasso di crescita tra i due lati del coleoptile, accelerato nella metà sottostante al blocco di gelatina. La regolarità della risposta permette di stabilire un saggio quantitativo: “Già i primi esperimenti mostrarono che su questa base poteva essere messo a punto un metodo quantitativo, in cui l’angolo di curvatura è la misura della quantità di regolatori di crescita che diffondono dagli apici nella gelatina.” - (fr:3087). La precisione è notevole, con un errore medio non superiore al 20%, sorprendente se confrontato con l’ampia variabilità delle curvature fototropiche naturali. Si traggono così due conclusioni cruciali: l’effetto di una data quantità di regolatori su diversi monconi è costante e la curvatura del moncone è uno strumento per determinare quantitativamente la quantità di regolatori.

La procedura standardizzata è descritta con rigore. Le coltivazioni e le manipolazioni avvengono in camera oscura a 20°C con luce rossa. Gli apici, lunghi 1-2 mm, sono tagliati da coleoptili alti 10-30 mm e posti brevemente su carta da filtro umida per rimuovere il contenuto delle cellule danneggiate. “Vengono poi posti vicini l’uno all’altro su una fetta sottile di gelatina al 10%.” - (fr:3096). È fondamentale usare sempre lo stesso numero di apici su superfici uguali. Dopo circa un’ora, gli apici sono rimossi e la gelatina, tagliata in piccoli blocchi, viene fatta aderire con gelatina fusa su un lato dei monconi decapitati. La decapitazione segue la tecnica di Stark e Drechsel (1922), con una porzione asportata di circa 5 mm, e la foglia primaria viene parzialmente estratta per evitare interferenze meccaniche. Dopo mezz’ora di riposo, si scartano le piante non più perfettamente diritte. La curvatura compare nell’ora successiva e si trasmette verso il basso, coinvolgendo dopo tre ore una zona di circa 15 mm. La misurazione avviene fotografando le piante su carta sensibile. I controlli confermano la specificità: la gelatina pura non causa mai curvature negative e, soprattutto, “se ne deduce che né dalla superficie di sezione né dalle cellule ordinarie del coleoptile diffondono nella gelatina sostanze che abbiano un’influenza marcata sulla crescita.” - (fr:3109).

Vengono poi indagate le proprietà chimico-fisiche di queste sostanze, fornendo prove della loro natura individuale. I regolatori mostrano una notevole stabilità: essiccata all’aria con umidità costante all’85%, la gelatina rimane attiva per lungo tempo. Dopo 2 giorni di essiccazione si misura una curvatura di 18°.2 ± 0°.2, dopo 11 giorni ancora una curvatura di 10° ± 1°.2, e “anche dopo 43 giorni produceva ancora curvature negative.” - (fr:3112). Inoltre, la diluizione della gelatina contenente i regolatori con un uguale quantitativo di gelatina pura riduce l’attività in modo proporzionale, un comportamento che “indica la loro individualità come sostanze.” - (fr:3115).

Infine, il testo affronta il problema del trasporto di questi regolatori, confrontandosi con esperimenti precedenti. L’autore riscalda la gelatina con i regolatori a 40°, 60° e 90°, osservando che anche dopo un minuto a 90° essa conserva la capacità di produrre forti curvature. Ciò contrasta con gli esperimenti di Fitting (1907), dove il riscaldamento di un disco di coleoptile a 43°C bloccava la trasmissione dello stimolo. La deduzione è che il calore blocca il trasporto, non distrugge le sostanze: “Quindi negli esperimenti di Fitting solo il trasporto delle sostanze stimolanti, in questo caso i regolatori di crescita, può essere stato fermato, senza che le sostanze stesse venissero distrutte.” - (fr:3120). Questo trasporto è per lo più un processo attivo delle cellule viventi, poiché la semplice diffusione non può spiegare la velocità osservata. La teoria di Brauner (1922), che considera la corrente protoplasmatica come fattore principale, è ritenuta più probabile dall’autore rispetto a quella di Paal, portando a una definizione personale del meccanismo: “Per trasporto dei regolatori di crescita intendo la diffusione da protoplasto a protoplasto attraverso la parete cellulare, e per il resto una distribuzione meccanica nella cellula tramite corrente protoplasmatica.” - (fr:3124).

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17 L’azione delle piante sull’aria: dalla luce come fattore indispensabile alla quantificazione del ruolo dell’anidride carbonica

Dagli esperimenti di Priestley alla prima trattazione quantitativa della fotosintesi, il testo segue il passaggio dalla nozione di “aria deflogisticata” alla dimostrazione che le piante decompongono l’anidride carbonica fissando il carbonio e liberando ossigeno, e che tale processo dipende dalla luce solare e dalle sole parti verdi.

Il resoconto si apre con Joseph Priestley, il quale, dopo aver osservato che piante di menta cresciute per mesi in aria confinata non solo non la rendevano irrespirabile ma la rigeneravano al punto da permettere a una candela di ardere e a un topo di sopravvivere (“One might have imagined … the air would neither extinguish a candle, nor was it at all inconvenient to a mouse, which I put into it” – fr:3227 [Si poteva immaginare … l’aria non spegneva una candela, né arrecava alcun disturbo a un topo che vi avevo introdotto]), giunse a sospettare che la vegetazione fosse in grado di restaurare l’aria viziata dalla combustione. L’esperienza cruciale è datata 17 agosto 1771: un rametto di menta posto in aria dove una candela di cera si era spenta la rese, dopo dieci giorni, nuovamente adatta a sostenere una fiamma (“on the 17th of August, 1771, I put a sprig of mint into a quantity of air, in which a wax candle had burned out, and found that, on the 27th of the same month, another candle burned perfectly well in it” – fr:3236 [il 17 agosto 1771 misi un rametto di menta in una quantità d’aria in cui una candela di cera si era spenta, e trovai che il 27 dello stesso mese un’altra candela bruciava perfettamente in essa]), un risultato replicato «non meno di otto o dieci volte» (“not less than eight or ten times in the remainder of the summer” – fr:3237 [non meno di otto o dieci volte nel resto dell’estate]). Priestley attribuiva però questo potere alla crescita della pianta in quanto tale (“Priestley had assumed that the purification of air by plants was a consequence of their growth” – fr:3257 [Priestley aveva supposto che la purificazione dell’aria da parte delle piante fosse una conseguenza della loro crescita]).

La svolta giunse con John Ingen-Housz, il quale, nell’estate del 1778, condusse circa cinquecento esperimenti che gli permisero di affermare con nettezza che la correzione dell’aria non dipende dalla vegetazione ma dall’influenza della luce solare. Egli osservò che le piante compiono tale ufficio in modo completo in poche ore (“I observed, that plants not only have a faculty to correct bad air in six or ten days … but that they perform this important office in a compleat manner in few hours; that this wonderful operation is by no means owing to the vegetation of the plant, but to the influence of the light of the sun upon the plant” – fr:3263-3264 [Osservai che le piante non solo hanno la facoltà di correggere l’aria cattiva in sei o dieci giorni … ma che compiono questa importante funzione in modo completo in poche ore; che questa meravigliosa operazione non è affatto dovuta alla vegetazione della pianta, ma all’influenza della luce del sole sulla pianta]). Le piante, inoltre, elaborano l’aria che contengono trasformandola in “vera e fine aria deflogisticata” (ossigeno), riversandone una pioggia continua nell’atmosfera, ma solo dopo che il sole è comparso sull’orizzonte; l’operazione cessa del tutto al tramonto (“that this operation is far from being carried on constantly, but begins only after the sun has for some time made his appearance above the horizon” – fr:3265 [che questa operazione è lungi dall’essere condotta costantemente, ma inizia solo dopo che il sole ha fatto per qualche tempo la sua comparsa sopra l’orizzonte]). Di conseguenza, piante poste all’ombra di edifici o di altra vegetazione non compiono quest’ufficio e anzi contaminano l’aria circostante con esalazioni dannose per gli animali (“plants shaded by high buildings, or growing under a dark shade of other plants, do not perform this office, but, on the contrary, throw out an air hurtful to animals” – fr:3266 [le piante ombreggiate da alti edifici, o che crescono sotto l’ombra scura di altre piante, non svolgono questa funzione, ma, al contrario, emettono un’aria dannosa per gli animali]).

Ingen-Housz precisò che l’organo responsabile di questa proprietà è circoscritto alle foglie e ai gambi verdi che le sostengono (“this office is not performed by the whole plant, but only by the leaves and the green stalks that support them” – fr:3266 [questa funzione non è svolta dall’intera pianta, ma solo dalle foglie e dai gambi verdi che le sostengono]). Fiori, radici e frutti, al contrario, rendono l’aria nociva sia di giorno sia di notte; perfino frutti deliziosi come le pesche possono contaminare l’aria comune a tal punto da mettere in pericolo la vita in ambienti chiusi (“all flowers render the surrounding air highly noxious, equally by night and by day; … fruits have the same deleterious quality at all times, … even some of those fruits which are the most delicious, as, for instance, peaches, contaminate so much the common air as would endanger us to lose our lives” – fr:3267 [tutti i fiori rendono l’aria circostante altamente nociva, tanto di notte quanto di giorno; … i frutti hanno la stessa qualità deleteria in ogni momento, … anche alcuni di quei frutti che sono i più deliziosi, come ad esempio le pesche, contaminano l’aria comune a tal punto da mettere in pericolo la nostra vita]). La rapidità del fenomeno poteva essere sorprendente: una sola foglia di vite racchiusa in una fiala con aria viziata dal respiro la riportava alla qualità dell’aria comune in un’ora e mezza (“One leaf of a vine, shut up in an ounce phial, full of air fouled by breathing so that a candle could not burn in it, restored this air to the goodness of common air in the space of an hour and a half” – fr:3272 [Una foglia di vite, chiusa in una fiala da un’oncia, piena d’aria inquinata dal respiro tanto che una candela non poteva bruciarvi, ripristinò quest’aria alla bontà dell’aria comune nello spazio di un’ora e mezza]). Tra le piante più efficaci, il nasturzio (adieu m suriiassed) forniva in due ore, da cento foglie, un volume d’aria deflogisticata capace di riempire un cilindro di vetro di quattro pollici e mezzo di profondità e un pollice e tre quarti di diametro (“One hundred leaves of this plant … yielded, in two hours time, as much dephlogisticated air as would fill a cylindrical glass four inches and a half deep, and one inch and three quarters diameter” – fr:3287 [Cento foglie di questa pianta … produssero in due ore tanta aria deflogisticata quanta ne riempirebbe un cilindro di vetro di quattro pollici e mezzo di profondità e un pollice e tre quarti di diametro]).

Queste scoperte furono inizialmente inquadrate nella teoria del flogisto, all’epoca ancora dominante nonostante Lavoisier ne avesse appena compiuto la confutazione (“At the time, Lavoisier’s refutation of the phlogiston theory had just been accomplished, but his viewpoint had not yet supplanted the old doctrine” – fr:3260 [A quell’epoca, la confutazione della teoria del flogisto da parte di Lavoisier era appena stata compiuta, ma il suo punto di vista non aveva ancora soppiantato la vecchia dottrina]). Lo stesso Ingen-Housz discusse i suoi risultati in termini di aria flogisticata e deflogisticata; solo anni dopo, nel suo Saggio sulla nutrizione delle piante (1796), li reinterpretò alla luce della nuova chimica (“In this book, therefore, we find Ingen-Housz discussing his results in terms of the phlogiston theory” – fr:3261 [In questo libro, quindi, troviamo Ingen-Housz che discute i suoi risultati in termini di teoria del flogisto]; “Years later, in his Essay on the Nutrition of Plants … Ingen-Housz re-interpreted his earlier work in line with the new chemistry” – fr:3262 [Anni dopo, nel suo Saggio sulla nutrizione delle piante … Ingen-Housz reinterpretò il suo precedente lavoro in linea con la nuova chimica]).

Il salto successivo è rappresentato dal lavoro di Nicolas-Théodore de Saussure, che, sfruttando le acquisizioni di Lavoisier sulla composizione dell’anidride carbonica e sulla sintesi dell’acqua, condusse la prima trattazione quantitativa della fotosintesi. Sua premessa fu l’osservazione che una pianta di menta nutrita con acqua e posta in una corrente d’aria mescolata a gas acido carbonico prosperava meglio di una in aria atmosferica pura. De Saussure si propose quindi di determinare la quantità ottimale di anidride carbonica. Allevò piante di pisello fino al peso di un grammo e le espose per dieci giorni a miscele di aria ordinaria e CO₂, in luce solare diretta per cinque o sei ore al giorno (“I attempted to confirm this observation and to determine the amount of carbonic acid which, mixed with atmospheric air, has a beneficial influence on the growing plant” – fr:3322 [Tentai di confermare questa osservazione e di determinare la quantità di acido carbonico che, mescolato all’aria atmosferica, ha un’influenza benefica sulla pianta in crescita]). In luce solare, le piante in aria pura aumentarono di peso in media di 425 mg; se l’atmosfera conteneva metà del proprio volume di CO₂, la crescita si arrestava dopo sette giorni; con 1/12 di CO₂ l’aumento medio raggiunse invece 583 mg, valore superiore a quello ottenuto in aria ordinaria (“The average gain of each plant in an atmosphere of ordinary air of which carbonic acid gas comprised 1/12 amounted to 583 mg” – fr:3335 [L’aumento medio di ciascuna pianta in un’atmosfera di aria ordinaria di cui il gas acido carbonico costituiva 1/12 ammontava a 583 mg]). Cruciale fu la verifica che le piante nella miscela artificiale trasformavano quasi tutto il gas acido carbonico in ossigeno (“those, however, which grew in the artificial mixture, transformed nearly all the carbonic acid gas to oxygen” – fr:3337 [quelle, invece, che crescevano nella miscela artificiale trasformarono quasi tutto il gas acido carbonico in ossigeno]), mentre quelle in aria pura non alteravano sensibilmente né purezza né volume dell’atmosfera. All’ombra, invece, anche la minima aggiunta di CO₂ risultava dannosa e le piante morivano o crescevano stentatamente (“In the apparatus set up in the shade, the slightest amount of carbonic acid gas mixed with ordinary air was harmful to growing plants” – fr:3340 [Negli apparecchi posti all’ombra, la minima quantità di gas acido carbonico mescolata all’aria ordinaria era dannosa per le piante in crescita]).

Per dimostrare che l’anidride carbonica era indispensabile alla sopravvivenza delle foglie al sole, de Saussure introdusse un ramo frondoso in un globo di vetro contenente calce, che assorbe il gas. Le foglie rimasero verdi per quattordici giorni, poi si seccarono e caddero; un ramo simile in un globo senza calce si mantenne fresco per oltre due mesi. Quando la calce, saturatasi di CO₂, perse efficacia, il ramo produsse nuove foglie, dimostrando che la caduta non era dovuta a mancanza di ossigeno ma all’assenza di anidride carbonica (“These new formations of leaves show that the fall of leaves is not to be ascribed to deprivation of oxygen … but merely to the absence of the latter” – fr:3353 [Queste nuove formazioni di foglie mostrano che la caduta delle foglie non è da attribuire alla privazione di ossigeno … ma semplicemente all’assenza di quest’ultimo]).

In precedenza Senebier aveva già scoperto che le foglie decompongono il gas acido carbonico assimilando il carbonio e liberando ossigeno (“Senebier discovered that leaves decompose carbonic acid gas by assimilating the carbon and separating the oxygen” – fr:3356 [Senebier scoprì che le foglie decompongono il gas acido carbonico assimilando il carbonio e separando l’ossigeno]), ma mancava un’analisi quantitativa del bilancio tra l’ossigeno prodotto e quello contenuto nel CO₂. De Saussure si dedicò proprio a questo problema, allestendo atmosfere artificiali di volume noto (“Out of carbonic acid gas and ordinary air … I made up an artificial atmosphere which occupied 746 liters” – fr:3362 [Con gas acido carbonico e aria ordinaria … preparai un’atmosfera artificiale che occupava 5,746 litri]) e ponendo le basi per la moderna stechiometria della fotosintesi. Il suo lavoro, benché ancora privo di una chiara distinzione tra elementi e composti (la teoria atomica di Dalton era di là da venire), costituisce la prima trattazione quantitativa del processo espressa in termini quasi moderni (“this work stands as the first quantitative treatment of photosynthesis, expressed in what are almost modern terms” – fr:3320 [quest’opera rappresenta il primo trattamento quantitativo della fotosintesi, espresso in quelli che sono quasi termini moderni]). Il passaggio dalle descrizioni ingen-housziane, ancora intrise di flogisto, alle misure di de Saussure condensa in pochi decenni una rivoluzione concettuale che rese possibile leggere la nutrizione vegetale come assimilazione del carbonio atmosferico mediata dalla luce.

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[18.1/1-77-3460|3535]

18 La fotosintesi come processo redox unificato: dal dogma dell’ossigeno all’ipotesi del donatore di idrogeno

L’evoluzione del pensiero biochimico sulla fotosintesi, dalla “combustione lenta” di Lavoisier alla concezione unitaria di van Niel, mostra come la convergenza di linee di ricerca abbia rivelato la natura chimica profonda del metabolismo e ridefinito il ruolo della luce e dei donatori di idrogeno negli organismi fototrofi.

L’articolo, riprodotto con il permesso della Stanford University Press, si apre con una dichiarazione d’intenti che ne inquadra il significato storico: “In large measure, the progress of a science can be measured by the extent to which its various lines of investigation have converged so as to bring the phenomena it describes within a common conceptual scheme.” – (fr:3463) [In larga misura, il progresso di una scienza può essere misurato dal grado in cui le sue diverse linee di indagine sono convergite a tal punto da ricondurre i fenomeni che descrive entro uno schema concettuale comune.] La maturità della biologia è individuata nella scoperta dell’uniformità dei sistemi protoplasmatici e, nel campo della fotosintesi, il lavoro di van Niel rappresenta un esempio brillante di approccio sintetico, che chiarisce l’unità biochimica alla base di organismi metabolicamente diversi ma capaci di usare l’energia luminosa nella nutrizione (fr:3464-3465). L’implicazione più celebre di questo lavoro – che l’ossigeno liberato in fotosintesi derivi dalla decomposizione dell’acqua – trovò conferma sperimentale nel 1941 ad opera di Ruben e collaboratori (fr:3466).

La cornice storica ripercorre le tappe che hanno condotto a questa sintesi. Fu Lavoisier a riconoscere per primo l’importanza dell’ossigeno atmosferico per i processi vitali, concludendo che esso fosse indispensabile per ogni essere vivente e interpretando il metabolismo come una “combustione lenta” della materia organica (fr:3467-3468). Questa visione resse fino agli studi di Pasteur sui microrganismi anaerobi, che portarono alla formulazione della celebre frase: “La fermentation c’est la vie sans air.” – (fr:3469) [La fermentazione è la vita senz’aria.] Qui si apriva una frattura: esistevano processi metabolici in completa assenza di ossigeno libero. Tuttavia, come osserva il testo, “Yet there should be something in common in these two widely divergent phenomena of living matter; the ‘slow combustion’ as well as the ‘fermentation’ would appear to represent merely two different aspects of this common feature.” – (fr:3470) [Eppure doveva esserci qualcosa in comune in questi due fenomeni così divergenti della materia vivente; la “combustione lenta” così come la “fermentazione” apparivano rappresentare semplicemente due aspetti diversi di questa caratteristica comune.] L’intuizione di Max Rubner permise poi di identificare nella liberazione di energia la funzione comune a entrambi (fr:3471).

Il contributo di Winogradsky nel 1887 spostò il confine del problema: egli formulò l’idea che le sostanze inorganiche potessero fungere da combustibile o fonte di energia per microrganismi inferiori, basandosi sugli esperimenti con i batteri solforati (fr:3472-3473). Tra questi, i batteri purpurei (Thiorhodaceae) apparivano forme peculiari, caratterizzate da cellule color porpora e note già da tempo (fr:3474). Winogradsky dimostrò che anch’essi ossidano l’idrogeno solforato a solfato, ma questi organismi sono anaerobi stretti e per l’ossidazione avrebbero bisogno di O₂ (fr:3475-3476). La sua ipotesi, che la presenza di minuscoli organismi verdi fornisse l’ossigeno necessario, si scontrava con le osservazioni di Engelmann del 1882, il quale aveva mostrato l’estrema sensibilità alla luce dei batteri purpurei e proposto che essi fossero capaci di fotosintesi con liberazione di ossigeno (fr:3477-3478, con il metodo dei batteri mobili, fr:3479-3480). Tuttavia, tutti i tentativi di dimostrare quella liberazione con tecniche diverse da quelle di Engelmann fallirono (fr:3481). Skene, nel 1914, pur coltivando i batteri in terreno minerale con H₂S in condizioni quasi anaerobiche, tornò all’ipotesi di Winogradsky, ma Bavendamm la giudicò altamente improbabile sulla base di colture prive di batteri verdi (fr:3482).

La discussione più chiara e critica apparve nel lavoro di Buder del 1919, che mise a fuoco la tensione teorica del momento: da un lato Engelmann spingeva ad attribuire al pigmento una funzione assimilatoria fotosintetica, dall’altro Winogradsky e Skene portavano a considerare l’ossidazione dell’H₂S come anello fondamentale del metabolismo (fr:3483-3484). Ciò implicherebbe l’esistenza di due fonti di energia per la riduzione della CO₂: la luce e l’energia chimica dell’ossidazione di H₂S. “From an energetic viewpoint I cannot see any difficulty in the way of this assumption.” – (fr:3487) [Da un punto di vista energetico non vedo alcuna difficoltà in questa assunzione.] Buder concluse che l’attività fotosintetica era quasi una conseguenza necessaria dei fatti osservati, ma, a differenza delle piante verdi, l’ossigeno liberato verrebbe immediatamente consumato per ossidare l’H₂S (fr:3488). Tuttavia restava una difficoltà: se i batteri purpurei potessero effettuare chemiosintesi e fotosintesi indipendentemente, potrebbero vivere anche in assenza di H₂S grazie alla sola fotosintesi, cosa che non avviene (fr:3489-3490, 3498-3499). Bavendamm, seguendo Buder, affermò che “the red sulphur bacteria can develop in the absence of oxygen and require CO₂, but also need oxygen for the oxidation of the H₂S, we must assume that the pigments play a role similar to the chlorophyll, i.e., that the purple sulphur bacteria can assimilate CO₂ in the light with a simultaneous liberation of oxygen.” – (fr:3491) [i batteri rossi dello zolfo possono svilupparsi in assenza di ossigeno e richiedono CO₂, ma necessitano anche di ossigeno per l’ossidazione dell’H₂S; dobbiamo supporre che i pigmenti giochino un ruolo simile alla clorofilla, cioè che i batteri purpurei possano assimilare CO₂ alla luce con simultanea liberazione di ossigeno.] Eppure, lo stesso Bavendamm ribadì poco dopo che l’H₂S è assolutamente necessario per entrambi i gruppi, incolori e rossi (fr:3494). Qui, dichiara van Niel, sta il nocciolo del problema: “We must account for the fact that they cannot live except in the presence of both H₂S and light.” – (fr:3496) [Dobbiamo spiegare il fatto che essi non possono vivere se non in presenza sia di H₂S che di luce.]

L’ipotesi di una coesistenza indipendente di foto- e chemiosintesi diventa quantitativamente insostenibile non appena si esaminano i numeri. Assumendo per la chemiosintesi i dati di Winogradsky sui batteri solforati incolori, servirebbero 80 molecole di CO₂ ridotte per via fotosintetica per fornire l’ossigeno necessario alla riduzione chemiosintetica di una sola molecola di CO₂ (fr:3500-3501). “Quantitatively, then, it appears that there is no necessity for the existence of a chemosynthetic reaction.” – (fr:3502) [Quantitativamente, quindi, appare che non vi sia alcuna necessità dell’esistenza di una reazione chemiosintetica.] Anzi, sarebbe assurdo pensare che proprio la reazione chemiosintetica, resa possibile solo dalla previa produzione fotosintetica di ossigeno, fornisca l’energia per ridurre quella parte di CO₂ che per qualche oscura ragione non potrebbe essere ridotta fotosinteticamente (fr:3503). L’H₂S come fonte indipendente di energia è altamente improbabile, e occorre un’altra spiegazione per il fatto che non si osservi attività fotosintetica in assenza di questo composto (fr:3504).

La risposta arriva ridefinendo la fotosintesi stessa sulla base della teoria dell’ossidoriduzione di Wieland e del concetto di “unità in biochimica” proposto da Kluyver e Donker. La reazione schematizzata CO₂ + H₂O = CH₂O + O₂ è un tipico processo redox in cui la CO₂ è ridotta e H₂O è ossidata (fr:3506-3507). Thunberg per primo applicò lo schema di Wieland, secondo cui tutte le ossidazioni consistono nel trasferimento di idrogeno da un donatore a un accettore: nella fotosintesi l’acqua agisce da donatore di idrogeno, la CO₂ da accettore e l’ossigeno sviluppato non è altro che acqua deidrogenata (fr:3508-3510). Kluyver e Donker formularono una teoria secondo la quale ogni organismo è in grado di attivare specifici atomi di idrogeno di un dato substrato; quando l’attivazione raggiunge un certo livello, l’idrogeno attivato può essere trasferito a un accettore anch’esso attivato (fr:3512-3513). Questa ipotesi di lavoro, corroborata da molti studi sul metabolismo microbico, offre una via per spiegare anche il comportamento dei batteri purpurei (fr:3514-3515).

Se si considera la riduzione della CO₂ alla luce di questo schema, nelle piante verdi l’idrogeno dell’acqua viene attivato a sufficienza per essere trasferito alla CO₂ (fr:3516). È però concepibile che altri organismi possano raggiungere lo stesso grado di attivazione soltanto quando agiscono su composti idrogenati diversi (fr:3517). La diversa capacità di attivare l’idrogeno da substrati intermedi è illustrata dal confronto tra il B. Savastanoi, che ossida il destrosio solo ad acido gluconico, e l’Acetobacter suboxydans, capace di spingersi fino all’acido ossigluconico ma non oltre, mentre altri microbi possono ossidare ulteriormente (fr:3518-3530). Applicando questo principio alla fotosintesi, la reazione generale CO₂ + 2 H₂A → CH₂O + H₂O + 2A mostra che il donatore H₂A può variare da organismo a organismo (fr:3531). “From which it follows that the photosynthetic activity of the chlorophyll-bearing organisms, in which H₂A represents H₂O, represents only one very special instance of a group of possible photosynthetic activities.” – (fr:3532) [Da ciò consegue che l’attività fotosintetica degli organismi contenenti clorofilla, in cui H₂A rappresenta H₂O, rappresenta solo un caso molto particolare di un gruppo di possibili attività fotosintetiche.] Per i batteri purpurei, allora, il donatore di idrogeno utilizzabile non è l’acqua, bensì l’H₂S (fr:3533).

Van Niel può così affermare che i risultati sono in pieno accordo con questa ipotesi. Se chemiosintesi e fotosintesi coesistessero indipendentemente – l’una producendo H₂SO₄ mediante ossidazione di H₂S, l’altra liberando O₂ e formando composto organico a partire da CO₂ – non vi sarebbe alcuna relazione quantitativa fissa tra i prodotti finali H₂SO₄, O₂ e CO₂ ridotta (fr:3534-3535). L’assenza di una tale stechiometria indipendente e la dipendenza assoluta dalla presenza contemporanea di H₂S e luce ricevono così una cornice teorica unitaria: la fotosintesi dei batteri purpurei è un processo redox in cui l’H₂S è il donatore di idrogeno, esattamente come l’H₂O lo è per le piante verdi, e l’ossidazione del donatore e la riduzione della CO₂ sono due facce della medesima reazione fotochimica, non due processi separati.

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19 L’origine dei vermi dalla carne: gli esperimenti di Francesco Redi

Francesco Redi descrive con precisione le fasi attraverso cui i vermi comparsi nella carne in decomposizione si trasformano in mosche, avanzando poi una serie di esperimenti controllati per verificare l’ipotesi che tali organismi non nascano per generazione spontanea dalla putrefazione, ma provengano esclusivamente da uova deposte da insetti adulti.

Le osservazioni prendono avvio dalla metamorfosi dei vermi. “On the nineteenth day of the same month some of the worms ceased all movements, as if they were asleep, and appeared to shrink and gradually to assume a shape like an egg.” – (fr:3840) [Il diciannovesimo giorno dello stesso mese alcuni vermi cessarono ogni movimento, come se fossero addormentati, e sembrarono contrarsi e assumere gradualmente una forma simile a un uovo.] Il giorno successivo la trasformazione si completava: “On the twentieth day all the worms had assumed the egg shape, and had taken on a golden white color, turning to red, which in some darkened, becoming almost black.” – (fr:3841) [Il ventesimo giorno tutti i vermi avevano assunto la forma di uovo e avevano acquisito un colore bianco dorato, virando al rosso, che in alcuni si scuriva diventando quasi nero.] In questa fase, “the red, as well as the black ones, changed from soft to hard, resembling somewhat those chrysalides formed by caterpillars, silkworms, and similar insects.” – (fr:3842) [I rossi, come i neri, passavano da molli a duri, somigliando un poco alle crisalidi formate da bruchi, bachi da seta e insetti simili.]

Redi nota alcune differenze morfologiche tra le due tipologie di involucri, che chiama “uova” sebbene il contesto indichi si tratti di pupe – un uso terminologico mutuato da Harvey, per il quale ogni massa embrionale era un “uovo” (fr:3844-3845). Scrive infatti: “I noticed that there was some difference in shape between the red and the black eggs [pupae], though it was clear that all were formed alike of many rings joined together; nevertheless, these rings were more sharply outlined, and more apparent in the black than in the red, which last were almost smooth and without a slight depression at one end, like that in a lemon picked from its stalk, which further distinguished the black egg-like balls.” – (fr:3843) [Notai che c’era una certa differenza di forma tra le uova rosse e quelle nere [pupe], benché fosse chiaro che tutte erano formate similmente da molti anelli uniti insieme; tuttavia questi anelli erano delineati in modo più netto e più evidente nei neri che nei rossi, i quali ultimi erano quasi lisci e privi di una leggera depressione a un’estremità, simile a quella di un limone staccato dal picciolo, che distingueva ulteriormente le palline nere a forma di uovo.]

Isolando questi involucri in vasi di vetro coperti di carta, Redi registra tempi di schiusa differenti. “I placed these balls separately in glass vessels, well covered with paper, and at the end of eight days, every shell of the red balls was broken, and from each came forth a fly of gray color, torpid and dull, misshapen as if half finished, with closed wings; but after a few minutes they commenced to unfold and to expand in exact proportion to the tiny body, which also in the meantime had acquired symmetry in all its parts.” – (fr:3844, 3846) [Posi queste palline separatamente in vasi di vetro, ben coperti di carta, e alla fine di otto giorni ogni guscio delle palline rosse si ruppe e da ciascuna uscì una mosca di colore grigio, torpida e spenta, deforme come fosse finita a metà, con le ali chiuse; ma dopo pochi minuti cominciarono a dispiegarsi e a espandersi in esatta proporzione col minuscolo corpo, che nel frattempo aveva anch’esso acquisito simmetria in tutte le sue parti.] La metamorfosi prosegue rapidamente: “Then the whole creature, as if made anew, having lost its gray color, took on a most brilliant and vivid green; and the whole body had expanded and grown so that it seemed incredible that it could ever have been contained in the small shell.” – (fr:3847) [Poi l’intera creatura, come se fosse stata rifatta di nuovo, perso il colore grigio, assunse un verde brillantissimo e vivido; e l’intero corpo si era espanso e cresciuto tanto che sembrava incredibile fosse mai potuto essere contenuto in quel piccolo guscio.] Le pupe nere, invece, impiegano più tempo: “Though the red eggs [pupae] brought forth green flies at the end of eight days, the black ones labored fourteen days to produce certain large black flies striped with white, having a hairy abdomen, of the kind that we see daily buzzing about butchers’ stalls.” – (fr:3848) [Mentre le uova rosse [pupe] producevano mosche verdi dopo otto giorni, quelle nere impiegavano quattordici giorni per generare certe grosse mosche nere striate di bianco, con l’addome peloso, del tipo che vediamo ogni giorno ronzare attorno alle bancarelle dei macellai.]

Per verificare la generalità del fenomeno, Redi estende le prove a numerose specie animali. “…I continued similar experiments with the raw and cooked flesh of the ox, the deer, the buffalo, the lion, the tiger, the dog, the lamb, the kid, the rabbit; and sometimes with the flesh of ducks, geese, hens, swallows, etc., and finally I experimented with different kinds of fish, such as sword-fish, tun, eel, sole, etc.” – (fr:3849) […continuai esperimenti simili con la carne cruda e cotta di bue, cervo, bufalo, leone, tigre, cane, agnello, capretto, coniglio; e talvolta con la carne di anatre, oche, galline, rondini, ecc., e infine sperimentai con diversi tipi di pesce, come pesce spada, tonno, anguilla, sogliola, ecc.] Il risultato è costante: “In every case, one or other of the abovementioned kinds of flies were hatched, and sometimes all were found in a single animal.” – (fr:3850) [In ogni caso, venivano schiuse l’una o l’altra delle suddette specie di mosche, e a volte tutte si trovavano in un singolo animale.] Osserva inoltre minutissime mosche nere e nota che “almost always I saw that the decaying flesh and the fissures in the boxes where it lay were covered not alone with worms, but with the eggs from which, as I have said, the worms were hatched.” – (fr:3851) [quasi sempre vedevo che la carne in decomposizione e le fessure delle scatole dove giaceva erano coperte non solo di vermi, ma anche delle uova dalle quali, come ho detto, i vermi nascevano.]

Queste uova richiamano alla mente un sapere condiviso: “These eggs made me think of those deposits dropped by flies on meats, that eventually become worms, a fact noted by the compilers of the dictionary of our Academy, and also well known to hunters and to butchers, who protect their meats in Summer from filth by covering them with white cloths.” – (fr:3852) [Queste uova mi fecero pensare a quei depositi lasciati dalle mosche sulle carni, che alla fine diventano vermi, un fatto notato dai compilatori del dizionario della nostra Accademia, e ben noto anche ai cacciatori e ai macellai, che d’estate proteggono le loro carni dalla sporcizia coprendole con teli bianchi.] Cita persino l’Iliade a supporto della consapevolezza antica del fenomeno: “Hence great Homer, in the nineteenth book of the Iliad, has good reason to say that Achilles feared lest the flies would breed worms in the wounds of dead Patrocles, whilst he was preparing to take vengeance on Hector.” – (fr:3853) [Perciò il grande Omero, nel libro XIX dell’Iliade, ha buona ragione di dire che Achille temeva che le mosche generassero vermi nelle ferite del morto Patroclo, mentre si preparava a vendicarsi di Ettore.]

L’ipotesi prende forma: “Having considered these things, I began to believe that all worms found in meat were derived directly from the droppings of flies, and not from the putrefaction of the meat, and I was still more confirmed in this belief by having observed that, before the meat grew wormy, flies had hovered over it, of the same kind as those that later bred in it.” – (fr:3854) [Avendo considerato queste cose, cominciai a credere che tutti i vermi trovati nella carne derivassero direttamente dagli escrementi delle mosche, e non dalla putrefazione della carne, e fui ancor più confermato in questa convinzione dall’aver osservato che, prima che la carne diventasse verminosa, vi avevano ronzato sopra mosche della stessa specie di quelle che poi vi nascevano.]

Per trasformare la credenza in certezza, Redi allestisce l’esperimento decisivo. “Belief would be vain without the confirmation of experiment, hence in the middle of July I put a snake, some fish, some eels of the Arno, and a slice of milk-fed veal in four large, wide-mouthed flasks; having well closed and sealed them, I then filled the same number of flasks in the same way, only leaving these open.” – (fr:3855) [La credenza sarebbe vana senza la conferma dell’esperimento, perciò a metà luglio misi un serpente, del pesce, alcune anguille d’Arno e una fetta di vitella da latte in quattro grandi ampolle a bocca larga; dopo averle ben chiuse e sigillate, riempii poi lo stesso numero di ampolle allo stesso modo, solo lasciandole aperte.] I risultati sono netti: “It was not long before the meat and the fish, in these second vessels, became wormy and flies were seen entering and leaving at will; but in the closed flasks I did not see a worm, though many days had passed since the dead flesh had been put in them.” – (fr:3856) [Non passò molto tempo prima che la carne e il pesce, in questi secondi vasi, diventassero verminosi e si vedessero mosche entrare e uscire a piacimento; ma nelle ampolle chiuse non vidi un verme, sebbene fossero trascorsi molti giorni da quando la carne morta vi era stata posta.] Sul coperchio di carta dei vasi sigillati si notava talvolta “a deposit, or a maggot that eagerly sought some crevice by which to enter and obtain nourishment” – (fr:3857) [un deposito, o una larva che cercava avidamente qualche fessura da cui entrare e procurarsi nutrimento]. Intanto, i materiali in decomposizione mostravano esiti differenti: il serpente conservava forma e colore, le anguille diventavano una massa viscosa e gonfia, la vitella si induriva, mentre il pesce si dissolveva quasi del tutto (fr:3858).

Redi moltiplica le prove variando stagioni e recipienti (fr:3859). “In order to leave nothing undone, I even had pieces of meat put under ground, but though remaining buried for weeks, they never bred worms, as was always the case when flies had been allowed to light on the meat.” – (fr:3860) [Per non tralasciare nulla, feci persino interrare pezzi di carne, ma sebbene rimanessero sepolti per settimane, non generarono mai vermi, come invece accadeva sempre quando alle mosche era stato permesso di posarsi sulla carne.] Un’ulteriore conferma viene dall’uccisione deliberata dei vermi già formatisi: posti in un recipiente chiuso non produssero nulla, mentre in uno aperto si svilupparono uova, pupe e infine mosche comuni (fr:3861).

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20 La confutazione sperimentale dell’aura spermatica e l’affermarsi della fecondazione materiale

Attraverso una serie di ingegnosi esperimenti, viene demolita la teoria del vapore fecondante e si apre la strada alla fecondazione artificiale anche nei vivipari.

Il testo si inserisce nel vivo di una controversia che ha attraversato la storia della biologia: se a fecondare le uova fosse una parte sottile e volatile del seme, l’aura seminalis, oppure la sua componente materiale e visibile. L’autore descrive con precisione lo stato del dibattito, presentando le argomentazioni dei sostenitori dell’aura spermatica. Costoro, come riportato, “reflect upon the orifice of the egg canals or the Fallopian tubes, so narrow that a very fine probe cannot enter there, and which can hardly allow the passage of air; from which they conclude that the seminal liquid of the male […] cannot arrive at the ovaries where the embryos are lodged; but that they must be fertilized by the part of the semen which evaporates, and which they call aura spermatica” – (fr:3872) [Riflettono sull’orifizio degli ovidotti o tube di Falloppio, così stretto che una sonda sottilissima non vi può entrare e che a stento permette il passaggio d’aria; da ciò concludono che il liquido seminale del maschio non può giungere alle ovaie dove sono alloggiati gli embrioni, ma che questi debbano essere fecondati dalla parte del seme che evapora, e che chiamano aura spermatica]. A tali ragioni anatomiche si aggiungevano osservazioni ostetriche: “they rely upon the observations of some anatomists who have found the vagina of some pregnant women very narrow or perfectly closed; they dwell upon other observations which would have one believe that the semen does not penetrate into the uterus” – (fr:3871) [essi si basano sulle osservazioni di alcuni anatomisti che hanno trovato la vagina di alcune donne gravide molto stretta o perfettamente chiusa; insistono su altre osservazioni che farebbero credere che il seme non penetri nell’utero].

L’autore non si accontenta delle ragioni pro e contro già esistenti, poiché le ritiene non risolutive: “it has not been demonstrated that the spermatic vapor itself arrives at the ovaries just as it is not clear whether the material part of the semen that arrives at the ovaries and not the vaporous part of the semen is responsible for fertilization” – (fr:3876) [non è stato dimostrato che il vapore spermatico arrivi esso stesso alle ovaie, così come non è chiaro se sia la parte materiale del seme che giunge alle ovaie e non la parte vaporosa a essere responsabile della fecondazione]. Per dirimere la questione propone quindi un espediente metodologico decisivo: separare fisicamente il vapore dal corpo del seme, facendo in modo che gli embrioni siano lambiti esclusivamente dal vapore. Se si sviluppano, si avrà una prova a favore dell’aura; se muoiono, sarà dimostrata l’insufficienza del solo vapore.

L’apparato sperimentale descritto è un modello di semplicità ed efficacia. L’autore pone in un vetro da orologio poco meno di 11 grani di liquido seminale di rospo terrestre e in un vetro simile, appena più piccolo, sistema 20 uova (indicate nel testo, per la fedeltà alle concezioni preformiste, con il termine “tadpoles”), la cui gelatina le tiene saldamente aderenti alla concavità. Sovrappone i due vetri, sigillandoli di fatto, per cinque ore a una temperatura di 18 °C: “the drop of seminal liquid was placed precisely under the eggs, which must have been completely bathed by the spermatic vapor that arose; the more so since the distance between the eggs and the liquid was not more then 1 ligne” – (fr:3884) [la goccia di liquido seminale fu posta esattamente sotto le uova, che dovettero essere completamente immerse nel vapore spermatico che si levava; tanto più che la distanza tra le uova e il liquido non superava 1 linea (2,25 mm)]. Dopo cinque ore le uova sono ricoperte da una nebbia umida, a testimonianza che una parte del seme è effettivamente evaporata: la diminuzione di peso corrisponde a un grano e mezzo, dunque le uova sono state esposte a un grano e mezzo di vapore spermatico. Eppure, “in spite of this, the eggs, subsequently placed in water, perished” – (fr:3887) [nonostante ciò, le uova, successivamente poste in acqua, perirono].

Viene quindi introdotta una verifica quantitativa: un grano e mezzo di vapore, se fosse efficiente come il liquido originario, dovrebbe fecondare diverse migliaia di embrioni. Aumentando il dosaggio e la temperatura (espone i vetri al sole con un vetro interposto per non superare i 25 °C), dopo quattro ore le uova appaiono addirittura coperte da goccioline evidenti, ma “in spite of this, they did not develop” – (fr:3893) [ciò nonostante, non si svilupparono]. L’esperimento viene ripetuto con una cruciale variante di controllo: metà delle uova esposte al vapore viene messa in acqua (e perisce), l’altra metà viene inumidita con il residuo del seme dopo l’evaporazione. Quest’ultima si schiude con successo. Le due conclusioni sono lapidarie: “one, that the spermatic vapor of the semen of the toad is incapable of fertilization; the other, that the remainder of the semen, after a considerable evaporation, entirely preserves its fertilizing powers” – (fr:3896) [una, che il vapore spermatico del seme di rospo è incapace di fecondare; l’altra, che il residuo del seme, dopo un’evaporazione considerevole, conserva interamente il suo potere fecondante].

Per fugare ogni dubbio, l’autore realizza esperimenti anche in vasi aperti, per escludere che la mancata fecondazione dipenda dall’assenza di circolazione d’aria. Il risultato non cambia. Nell’esperimento finale, diverse decine di uova vengono immerse per alcuni minuti in una certa quantità di vapore spermatico raccolto: nessuna sopravvive; al contrario, undici uova su dodici toccate con il minuscolo residuo di mezzo grano rimasto dopo l’evaporazione si sviluppano regolarmente. La convergenza delle prove è schiacciante: “The conjunction of these facts evidently proves that fertilization in the terrestrial toad is not produced by the spermatic vapor but rather by the material part of the semen” – (fr:3899) [L’insieme di questi fatti prova con evidenza che la fecondazione nel rospo terrestre non è prodotta dal vapore spermatico ma piuttosto dalla parte materiale del seme]. Il risultato è confermato anche su altre specie di rospo, sulla rana acquatica e sulla raganella.

L’autore è tuttavia consapevole dei limiti dell’induzione: “The small number of facts which we have does not allow us, in good logic, to draw such a general conclusion: One can at the most think that this is probably so” – (fr:3903) [Il piccolo numero di fatti di cui disponiamo non permette, secondo buona logica, di trarre una conclusione così generale: si può al massimo pensare che sia probabilmente così]. Ciononostante, la solidità delle evidenze negative toglie definitivamente credito all’aura seminale. Il significato storico del brano risiede proprio in questa serrata sequenza sperimentale che sostituisce a un dibattito basato su apparenti necessità anatomiche e osservazioni ambigue una prova controllata, capace di separare la causa materiale da quella putativamente volatile.

Poste queste basi, l’autore può compiere il passo successivo: estendere la fecondazione artificiale dai vivipari a fecondazione esterna a quelli a fecondazione interna, citando il precedente successo con i bachi da seta e annunciando il proposito su una cagna di taglia media, “a water spaniel of medium size” – (fr:3906) [uno spaniel d’acqua di taglia media]. Il testo si colloca così come una testimonianza metodologica esemplare e come snodo fondamentale nel progredire della biologia sperimentale della riproduzione.

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[21.1/1-38-3988|4024]

21 Corrispondenza tra il primo solco del tuorlo e l’asse embrionale, e influenza dello spermatozoo

Osservazioni sperimentali dimostrano la corrispondenza primaria tra la prima segmentazione del tuorlo e l’asse corporeo del futuro girino, nonché la capacità dello spermatozoo di orientare tale solco con l’inseminazione artificiale.

L’autore affronta due questioni centrali nello sviluppo iniziale dell’uovo di rana: il rapporto tra il piano della prima divisione del tuorlo e l’orientamento definitivo dell’embrione, e l’effetto del punto di fecondazione artificiale sulla direzione del solco primario. La trattazione si apre con un’ammissione di difficoltà pregressa: “I have been long aware that the axis of the embryo was in the line of the first cleft of the yelk, but my endeavour to show this was not always satisfactory” – (fr:3988) [Sono stato a lungo consapevole che l’asse dell’embrione fosse nella linea del primo solco del tuorlo, ma il mio tentativo di dimostrarlo non era sempre soddisfacente]. L’ostacolo risiedeva “in consequence of the difficulty of making the egg keep a given position, whilst it was free to move” – (fr:3989) [in conseguenza della difficoltà di far mantenere all’uovo una posizione data, mentre era libero di muoversi]. L’adozione di una cella a tubo permise di superare l’impaccio e di ottenere prove agevolmente.

La prima serie osservativa (fr:3991-3997) descrive un uovo appena segmentato, posto in una celletta di vetro riempita d’acqua, con la superficie dorsale rivolta verso l’alto. Il ricercatore tracciò sulla lastrina di supporto un segno parallelo al solco primario e indicò con altri riferimenti le estremità del solco. Mantenendo il sistema a 60 °F, poté constatare che “At the time of the closing-in of the dorsal laminae, I found the correspondence between the axis of the embryo and the line of the first cleft to be exact” – (fr:3996) [Al momento della chiusura delle lamine dorsali, trovai che la corrispondenza tra l’asse dell’embrione e la linea del primo solco era esatta]. Poiché sapeva che si sarebbe prodotto del movimento, eseguì un disegno delle apparenze; dodici ore dopo il solco dorsale era quasi chiuso e l’embrione risultava spostato a sinistra del segno di riferimento, “to about an angle of 30°” – (fr:3999) [per un angolo di circa 30°]. Un secondo disegno fugava i dubbi; nei giorni successivi l’embrione ruotò ulteriormente, portandosi a sinistra. Ciononostante, l’individuo si perfezionò come gli altri del medesimo lotto allevati in massa. Il dato cruciale è così riassunto: “Although these observations have shown that the axis of the body of the future embryo corresponds primarily with the first cleft in the yelk, . . . at times, the axis deviates to the left or right of that line” – (fr:4003) [Sebbene queste osservazioni abbiano mostrato che l’asse del corpo dell’embrione futuro corrisponde primariamente al primo solco del tuorlo, … talvolta l’asse devia a sinistra o a destra di quella linea].

La seconda parte dell’indagine esamina “the power of the Spermatozoon to influence in artificial impregnation the direction of the first cleft of the Yelk” – (fr:4004) [il potere dello spermatozoo di influenzare, nell’inseminazione artificiale, la direzione del primo solco del tuorlo]. Per saggiare se l’applicazione dello sperma su parti diverse della superficie dell’uovo potesse condizionare la posizione del solco, l’autore allestì vari esperimenti. Nella prima osservazione (fr:4007-4013), uova disposte su un fianco in celle tubolari furono toccate con fluido spermatico fresco “to the lower part of the dark surface” – (fr:4008) [alla parte inferiore della superficie scura] e la cella venne marcata accanto al punto di contatto. Dopo la rotazione abituale che riporta in alto la superficie scura, solo due uova risultarono fecondate: in queste “the spherical vesicles had the usual position and appearance, and were directed outwards across the centre of the flat surface of the yelk to that side of the egg to which the spermatic fluid had been applied” – (fr:4010) [le vescicole sferiche avevano la posizione e l’aspetto consueti, ed erano dirette verso l’esterno attraverso il centro della superficie piatta del tuorlo verso il lato dell’uovo su cui era stato applicato il fluido spermatico]. Una volta comparso il solco primario, le uova furono segnate e messe da parte; al 3 aprile “Each egg has formed an embryo, and in each instance with the head to the side of the egg touched” – (fr:4013) [Ogni uovo ha formato un embrione, e in ogni caso con la testa rivolta al lato dell’uovo toccato].

Prove successive offrirono risultati sfumati ma convergenti. Nell’Osservazione 2 (fr:4015-4017) su quattro uova solo due furono produttive: in un caso “the primary cleft was in the precise line of the spot touched, although the egg subsequently diverged to the left; and the head corresponded to the part fecundated” – (fr:4016) [il solco primario era nella linea esatta del punto toccato, sebbene l’uovo successivamente divergesse a sinistra; e la testa corrispondeva alla parte fecondata]; nell’altro uovo il solco risultò spostato di circa dieci gradi a sinistra della zona trattata, ma anche qui la testa era rivolta al punto di applicazione. L’Osservazione 3 (fr:4019-4022) rivela un’anomalia: su quattro uova, due sterili, il primo solco cadde circa sei gradi a destra in un caso e cinque gradi a sinistra nell’altro. Entrambi diedero embrioni, ma “in one (a) the head was at the end of the cleft nearest the point touched, but in the other (b) at the end furthest from the same point” – (fr:4021) [in uno (a) la testa stava all’estremità del solco più vicina al punto toccato, ma nell’altro (b) all’estremità più lontana dallo stesso punto]. L’autore confessa: “The peculiarity in this last experiment I cannot explain; possibly there might be some want of precision in conducting it” – (fr:4022) [La peculiarità di quest’ultimo esperimento non posso spiegarla; forse ci potrebbe essere stata qualche mancanza di precisione nel condurlo].

La ripetizione per altre quattro volte di esperimenti analoghi confermò che “the first cleft of the yelk is in a line with the point of the egg artificially impregnated, and that the head of the young frog is turned towards the same point” – (fr:4023) [il primo solco del tuorlo è in linea con il punto dell’uovo inseminato artificialmente, e che la testa del giovane girino è rivolta verso lo stesso punto]. Tuttavia, anche in queste serie, “the nascent being in the course of its development deviated to the right or the left of a line through the centre of the spot fecundated” – (fr:4024) [l’essere nascente nel corso del suo sviluppo deviava a destra o a sinistra di una linea passante per il centro della zona fecondata]. Emerge dunque un duplice principio: il piano di segmentazione primaria e l’estremità cefalica sono determinati dal punto d’ingresso dello spermatozoo, ma la morfogenesi successiva introduce deviazioni regolari rispetto a tale asse originario.

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[22.1/1-53-4046|4097]

22 La Teoria della Continuità del Plasma Germinale di August Weismann

Weismann getta le basi della moderna genetica teorica, contrapponendo alla trasmissibilità dei caratteri acquisiti l’idea di una sostanza ereditaria immutabile e continua, il plasma germinale, il cui vero motore risiede nel nucleo cellulare.

Il testo si apre con un preciso inquadramento storico del contributo scientifico di Weismann, identificandone due pilastri fondamentali: l’intuizione del processo meiotico e il netto rifiuto dell’eredità lamarckiana. Egli “correctly perceived that heredity must depend upon the preservation of a molecular pattern and he predicted the necessary existence of meiosis” - (fr:4045) [percepì correttamente che l’ereditarietà deve dipendere dalla conservazione di un modello molecolare e predisse la necessaria esistenza della meiosi.]. Questa posizione, come sottolineato, “has profoundly influenced the thinking of most biologists since his time” - (fr:4046) [ha profondamente influenzato il pensiero della maggior parte dei biologi dopo di lui.], sancendo la portata rivoluzionaria della sua teoria.

Il problema centrale viene introdotto con una riflessione sulle meraviglie della trasmissione ereditaria. Di fronte alla precisione con cui minime peculiarità strutturali e mentali vengono trasmesse immutate per generazioni, sorge spontanea la domanda sulla causa di tale fenomeno. La risposta immediata colloca l’enigma in una singola cellula: “A single cell out of the millions of diversely differentiated cells which compose the body, becomes specialized as a sexual cell; it is thrown off from the organism and is capable of reproducing all the peculiarities of the parent body” - (fr:4048) [Una singola cellula tra i milioni di cellule diversamente differenziate che compongono il corpo, si specializza come cellula sessuale; viene espulsa dall’organismo ed è in grado di riprodurre tutte le peculiarità del corpo genitoriale.]. La questione si affina ulteriormente, chiedendosi come questa singola cellula possa riprodurre l’intero insieme del genitore “with all the faithfulness of a portrait” - (fr:4049) [con tutta la fedeltà di un ritratto.]. Weismann delimita quindi il suo compito alla questione fondamentale di come una cellula possa contenere in sé tutte le tendenze ereditarie dell’intero organismo.

Scartata l’ipotesi che la cellula germinale sia un estratto del corpo, Weismann delinea due sole alternative fisiologicamente concepibili. La prima è che la sostanza del germe parentale subisca una serie di cambiamenti ciclici che, dopo aver costruito un nuovo individuo, riconducano a cellule germinali identiche. La seconda, che egli sposa con convinzione, è che le cellule germinali, nella loro sostanza essenziale, non derivino affatto dal corpo dell’individuo, ma direttamente dalla cellula germinale parentale. Battezza questa ipotesi “The Continuity of the Germ-plasm” - (fr:4054) [la teoria della “Continuità del Plasma Germinale”], fondata sull’idea che l’ereditarietà sia realizzata dal trasferimento tra generazioni di una sostanza con una definita costituzione chimica e, soprattutto, molecolare. Questa sostanza, il plasma germinale, è assunta come dotata di una struttura altamente complessa che le conferisce il potere di svilupparsi in un organismo. Il meccanismo è lineare: in ogni ontogenesi, una parte del plasma germinale dell’uovo parentale non viene utilizzata per costruire il corpo della prole, ma è conservata immutata per formare le cellule germinali della generazione successiva. La semplicità di questa visione riduce l’ereditarietà a una questione di crescita e assimilazione, “the most fundamental of all vital phenomena” - (fr:4057) [il più fondamentale di tutti i fenomeni vitali.]. La continuità diretta fornisce un identico punto di partenza a ogni generazione successiva, spiegando così la formazione di un prodotto identico.

Tuttavia, Weismann riconosce che questa teoria incontra una difficoltà nella spiegazione della trasmissione dei cosiddetti caratteri acquisiti. Nella sua prima pubblicazione sull’ereditarietà, egli aveva già sostenuto che l’ipotesi della loro trasmissione fosse tutt’altro che provata e che intere classi di fatti potessero essere interpretate diversamente. Chiarisce quindi il significato di “carattere acquisito”: un organismo non può acquisire nulla se non possiede già la predisposizione per farlo. Un carattere acquisito non è altro che una variazione locale o generale che sorge sotto lo stimolo di influenze esterne. L’esempio è icastico: la crescita ossea nota come “Exercierknochen”, causata dalla pressione del fucile durante l’addestramento militare. “The predisposition towards an ‘Exercierknochen’ is therefore already present, or else the growth could not be formed” - (fr:4068) [La predisposizione verso un ‘Exercierknochen’ è quindi già presente, altrimenti la crescita non potrebbe formarsi.]. La conclusione è categorica: “Nothing can arise in an organism unless the predisposition to it is pre-existent, for every acquired character is simply the reaction of the organism upon a certain stimulus” - (fr:4069) [Nulla può sorgere in un organismo se la predisposizione ad esso non è preesistente, poiché ogni carattere acquisito è semplicemente la reazione dell’organismo a un certo stimolo.].

Weismann non nega la trasmissibilità delle predisposizioni. Ammette che la predisposizione all’“Exercierknochen” possa variare e che una predisposizione fortemente marcata possa essere trasmessa dal padre al figlio come una costituzione ossea più suscettibile. Ciò che nega con forza è la possibilità che il carattere acquisito in sé venga ereditato: “I should deny that the son could develop an ‘Exercierknochen’ without having drilled, or that, after having drilled, he could develop it more easily than his father, on account of the drilling through which the latter first acquired it” - (fr:4072) [Negherei che il figlio possa sviluppare un ‘Exercierknochen’ senza essersi addestrato, o che, dopo essersi addestrato, possa svilupparlo più facilmente di suo padre, a causa dell’addestramento attraverso cui quest’ultimo lo ha acquisito per primo.]. Non afferma che il plasma germinale sia assolutamente immutabile, ma che l’influenza della nutrizione e della crescita dell’individuo su di esso debba essere estremamente lieve e non possa agire nella maniera comunemente assunta. Un cambiamento periferico come l’“Exercierknochen” non può causare una modifica nella struttura molecolare del plasma germinale tale da aumentare la predisposizione in quel senso per la prole. Solo una delle cause che producono un carattere acquisito è trasmissibile: la predisposizione innata che origina dal germe, ed è del tutto irrilevante per la generazione successiva che tale predisposizione sia entrata o meno in funzione.

La teoria impone un drastico cambio di prospettiva. Le cellule germinali non sono più viste come un prodotto del corpo del genitore, ma “they are rather considered as something which is to be placed in contrast with the tout ensemble of the cells which make up the parent’s body” - (fr:4082) [sono piuttosto considerate come qualcosa che va posto in contrasto con l’insieme delle cellule che compongono il corpo del genitore.], in un rapporto simile a una serie di generazioni di organismi unicellulari nati per continua divisione cellulare.

La base di questa continuità risiede nel nucleo. Weismann concorda pienamente con Strasburger nell’affermare che “The specific qualities of organisms are based upon nuclei” - (fr:4087) [Le qualità specifiche degli organismi sono basate sui nuclei.]. Il nucleo impartisce il carattere specifico alla cellula, controllando l’assimilazione e dando al citoplasma una direzione di crescita peculiare della specie. Il nucleo, quindi, “determine the specific direction in which an organism develops” - (fr:4091) [determina la direzione specifica in cui un organismo si sviluppa.]. Questa visione è corroborata dagli esperimenti sulla rigenerazione degli Infusori condotti da Nussbaum e Gruber. Il dato cruciale è che i frammenti di questi organismi unicellulari privi di sostanza nucleare sono incapaci di rigenerarsi, mentre quelli che contengono un nucleo riescono sempre a farlo. La conclusione è definitiva: “It is therefore only under the influence of the nucleus that the cell substance re-develops into the full type of the species” - (fr:4096) [È quindi solo sotto l’influenza del nucleo che la sostanza cellulare si ri-sviluppa nel tipo completo della specie.]. Questa solida base citologica permette a Weismann di chiudere il suo ragionamento con un appello al principio di parsimonia, sostenendo che la teoria della continuità del plasma germinale, essendo la più semplice e quella più ovviamente suggerita dai fatti, meriti di essere esaminata in ogni dettaglio prima di essere abbandonata per una più complessa.

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[23.1/1-63-4339|4400]

23 La costrizione delle uova di Tritone e la potenza diseguale dei nuclei e dei territori citoplasmatici

La distribuzione asimmetrica dei nuclei durante le prime divisioni dell’uovo e la capacità di frammenti citoplasmatici privi di nucleo di generare un embrione completo costituirono il terreno su cui si innestarono le esperienze qui descritte. L’autore ripercorre le acquisizioni di Driesch, Born, O. Hertwig e J. Loeb, secondo i quali divisioni nucleari anomale provocate da deformazioni dell’uovo potevano essere realizzate in modo particolarmente nitido:

“These experiments of Driesch, Born, and O. Hertwig in which abnormal nuclear divisions were produced by deformations of the egg were complemented by an experiment of J. Loeb (1894) which this was achieved in an especially clear manner.” – (fr:4339) [Questi esperimenti di Driesch, Born e O. Hertwig, in cui divisioni nucleari anomale venivano prodotte da deformazioni dell’uovo, furono completati da un esperimento di J. Loeb (1894) in cui ciò fu ottenuto in modo particolarmente chiaro.]

Boveri dimostrò poi che la distribuzione casuale dei cromosomi doveva verificarsi anche nello sviluppo normale, poiché il meccanismo mitotico non prevede un’allocazione ordinata dei cromosomi figli disuguali:

“Boveri (1896, 1900) finally demonstrated that random distribution of chromosomes must also occur in normal development, since the nature of the mitotic mechanism does not provide for the orderly allocation of unlike daughter chromosomes.” – (fr:4338) [Boveri (1896, 1900) dimostrò infine che la distribuzione casuale dei cromosomi deve avvenire anche nello sviluppo normale, poiché la natura del meccanismo mitotico non consente un’allocazione ordinata dei cromosomi figli dissimili.]

La tecnica di Loeb per ottenere metà enucleate e studiarne lo sviluppo è rievocata in dettaglio. Uova di Arbacia venivano trasferite, dieci minuti dopo la fecondazione artificiale, in acqua di mare diluita a metà per un breve periodo:

“Eggs of Arbacia are transferred 10 minutes after artificial fertilization to one-half strength dilution of sea water for a short time.” – (fr:4340) [Uova di Arbacia vengono trasferite, 10 minuti dopo la fecondazione artificiale, in acqua di mare diluita a metà per un breve periodo.]

L’acqua assunta per osmosi faceva scoppiare la membrana dell’uovo, permettendo la fuoriuscita di parte della sostanza ovulare attraverso una stretta apertura mentre il resto rimaneva all’interno:

“The water taken in by osmosis then causes the egg membrane to burst.” – (fr:4341) [L’acqua assorbita per osmosi provoca quindi la rottura della membrana dell’uovo.]

“Thereupon a part of the egg substance flows out through the narrow opening, whereas the rest remains inside the membrane.” – (fr:4342) [Subito dopo una parte della sostanza dell’uovo fuoriesce attraverso la stretta apertura, mentre il resto rimane dentro la membrana.]

Si produceva così una metà enucleata separata dalla metà contenente il nucleo, collegate da un sottile ponte citoplasmatico:

“In this way an enucleate half is constricted off from the egg half which contains the nucleus, the two halves remaining connected by a more or less thin cytoplasmic bridge.” – (fr:4343) [In questo modo una metà enucleata viene separata per costrizione dalla metà dell’uovo che contiene il nucleo, restando le due metà connesse da un ponte citoplasmatico più o meno sottile.]

La segmentazione cominciava nella metà nucleata e, prima o poi, un nucleo migrava attraverso il ponte nell’altra metà inducendone lo sviluppo, con esito spesso in formazioni doppie o gemelli:

“Cleavage begins in the nucleated half; sooner or later a nucleus wanders across into the other half and causes it to develop.” – (fr:4344) [La segmentazione inizia nella metà nucleata; prima o poi un nucleo migra nell’altra metà e ne provoca lo sviluppo.]

“The results are double-formations or twins; i.e., the half with delayed nuclear supply also possesses the capacity to form an entire embryo, even though it has received only a derivative of the cleavage nucleus.” – (fr:4345) [I risultati sono formazioni doppie o gemelli; cioè la metà con rifornimento nucleare ritardato possiede anch’essa la capacità di formare un embrione intero, sebbene abbia ricevuto solo un derivato del nucleo di segmentazione.]

L’autore, Spemann, narra l’origine dei propri esperimenti: nell’estate del 1913, mentre insegnava a Otto Mangold la tecnica di costrizione delle uova di Triton, gli venne l’idea di trattenere il nucleo in una metà dell’uovo non fecondato per un certo tempo, così che iniziasse lì le sue divisioni, e solo in seguito una cellula figlia migrasse nel frammento enucleato:

“In the summer of 1913, when I was teaching Otto Mangold the technique of constricting Triton eggs, it occurred to me that it ought to be possible by this means to keep the nucleus within one half of the unfertilized egg for a time so that it would begin its cleavages there.” – (fr:4346) [Nell’estate del 1913, mentre insegnavo a Otto Mangold la tecnica di costringere le uova di Triton, mi venne in mente che con questo mezzo doveva essere possibile trattenere il nucleo in una metà dell’uovo non fecondato per un certo tempo, così che iniziasse lì le sue segmentazioni.]

“Only later would a daughter nucleus wander across the cytoplasmic bridge into the enucleate half and initiate cleavage there.” – (fr:4347) [Solo più tardi un nucleo figlio sarebbe migrato attraverso il ponte citoplasmatico nella metà enucleata e vi avrebbe iniziato la segmentazione.]

Il materiale sperimentale è costituito da uova di Triton taeniatus fecondate artificialmente o raccolte subito dopo la deposizione. Tali uova permettono di riconoscere l’area chiara con il primo e poi il secondo globulo polare, sotto cui giace il nucleo femminile, e i punti di entrata degli spermatozoi:

“MATERIAL AND METHODS Eggs of Triton taeniatus were used, either artificially fertilized or gathered shortly after they were laid on aquarium plants.” – (fr:4349) [MATERIALI E METODI Furono usate uova di Triton taeniatus, fecondate artificialmente o raccolte poco dopo la deposizione sulle piante dell’acquario.]

“Such eggs show a small light-colored area with a dark spot, the first and shortly afterwards also the second polar body under which the egg nucleus lies, and one or more small dark spots, the points of entry of spermatozoa.” – (fr:4350) [Queste uova mostrano una piccola area chiara con una macchia scura, il primo e subito dopo anche il secondo globulo polare sotto cui si trova il nucleo dell’uovo, e una o più piccole macchie scure, i punti di entrata degli spermatozoi.]

La costrizione veniva eseguita secondo le modalità già descritte. Grazie ai punti di repere si poteva stabilire quale metà contenesse il nucleo dell’uovo e se avesse ricevuto almeno uno spermatozoo:

“By means of the landmarks mentioned one can tell which half contains the egg nucleus, and whether it has received at least one spermatozoon.” – (fr:4352) [Grazie ai punti di riferimento menzionati si può capire quale metà contenga il nucleo dell’uovo e se abbia ricevuto almeno uno spermatozoo.]

Per riconoscere le due metà, l’uovo costretto veniva orientato in modo che il nodo della legatura si trovasse in basso e a destra del nucleo, e l’estremità del filo dal lato dell’osservatore veniva tagliata più corta dell’altra:

“In order to be able to identify both halves later on, the constricted egg was so oriented that the knot of the ligature was located on the underside and to the right of the egg nucleus; then the end of the ligature located on the side of the observer was cut off shorter than the other one.” – (fr:4353) [Per poter identificare in seguito entrambe le metà, l’uovo costretto veniva orientato in modo che il nodo della legatura si trovasse sul lato inferiore e a destra del nucleo dell’uovo; quindi l’estremità della legatura situata dal lato dell’osservatore veniva tagliata più corta dell’altra.]

Solo le uova con metà quasi uguali e membrane intatte venivano seguite ulteriormente.

L’esperimento I (Triton taeniatus 1914, J3) illustra il comportamento di un uovo fecondato artificialmente e costretto circa un’ora dopo. Il punto polare e il punto d’ingresso dello spermatozoo erano sullo stesso lato della legatura. La prima divisione, obliqua, comparve circa 6 ore e mezzo dopo la fecondazione, generando due cellule: una rappresentava circa ¾ dell’uovo, l’altra era divisa in due parti dalla strozzatura, la minore contenente il nucleo. La seconda divisione seguì circa un’ora e mezza più tardi; la cellula piccola si divise in due e dalla cellula grande si separò una piccola porzione esattamente sotto la legatura, segno che un nucleo era migrato nel semilato fino ad allora enucleato. L’embrione a quattro cellule presentava tre cellule più piccole da un lato e una più grande dall’altro. Il solco sotto la legatura era così profondo che con una costrizione appena più forte l’embrione si sarebbe diviso completamente; in questo caso le parti si riunirono presto. La divisione delle tre cellule più piccole avvenne un’ora e un quarto dopo, mentre quella della cellula grande cominciò con un ritardo di oltre mezz’ora, accrescendo il vantaggio dell’altra metà. In seguito le due metà si separarono del tutto: da una si sviluppò un embrione ben conformato, dall’altra un pezzo ventrale arrotondato non ulteriormente differenziato, indice che la costrizione era avvenuta in un piano frontale:

“Out of one a well-formed embryo developed; out of the other a rounded ventral piece, not further differentiated, a sure sign that the constriction had taken place in a frontal plane.” – (fr:4367) [Da una si sviluppò un embrione ben formato; dall’altra un pezzo ventrale arrotondato, non ulteriormente differenziato, segno sicuro che la costrizione era avvenuta in un piano frontale.]

In questo caso la metà ritardata ricevette non un nucleo figlio su due, ma uno su quattro, ossia ¼ anziché ½ del nucleo di segmentazione iniziale, e proprio questa metà produsse l’embrione, mentre la metà più avanzata, con ¾ dei nuclei di segmentazione, diede origine al pezzo ventrale:

“In this embryo therefore, as a result of the retention of the nucleus in one side, the other half received, not one of two daughter nuclei as is normal, but one of four nuclei, or to put it briefly, ¼ rather than ½ cleavage nucleus.” – (fr:4368) [In questo embrione, dunque, per effetto del trattenimento del nucleo in un lato, l’altra metà ricevette non uno dei due nuclei figli come di norma, ma uno di quattro nuclei, o per dirla in breve, ¼ anziché ½ del nucleo di segmentazione.]

“And it was just this half from which the embryo developed, while the advanced half with ¾ cleavage nuclei gave rise to the ventral piece.” – (fr:4369) [E fu proprio questa metà a sviluppare l’embrione, mentre la metà avanzata con ¾ dei nuclei di segmentazione diede origine al pezzo ventrale.]

L’esperimento 3 (Triton taeniatus 1914 N7) mostra la situazione con costrizione mediana e successiva migrazione di un nucleo figlio. L’uovo fu fecondato alle 24 e costretto il più strettamente possibile dopo circa mezz’ora; nucleo e spermatozoi erano tutti in una metà. La prima divisione apparve dopo 6 ore e mezzo, la seconda dopo un’altra ora, poi un solco orizzontale si completò alle 30. Fino a quel momento nessun solco si era formato accanto alla legatura; l’embrione era costituito da due metà separate da un profondo solco di costrizione, una segmentata e l’altra no. Tutti e otto i nuclei erano situati in una sola metà:

“At all events, all eight nuclei were located on one side of the ligature.” – (fr:4376) [In ogni caso, tutti e otto i nuclei erano situati su un lato della legatura.]

Alla divisione successiva un solco tagliò finalmente il gambo di collegamento, permettendo a un nucleo rappresentante ⅛ del nucleo zigotico di passare nella metà enucleata e iniziarne lo sviluppo:

“At the next division a furrow finally cut through the connecting stalk; a nucleus representing ⅛ of the zygote nucleus had therefore crossed over into the hitherto enucleate embryo half and initiated its development.” – (fr:4377) [Alla divisione successiva un solco tagliò infine il gambo di connessione; un nucleo rappresentante ⅛ del nucleo zigotico era quindi passato nella metà embrionale fino ad allora enucleata e ne aveva iniziato lo sviluppo.]

La prima segmentazione in questa metà apparve quasi due ore dopo, quando l’altra metà si era già divisa almeno due volte. Le due metà, quasi completamente separate, diedero origine a due gemelli la cui differenza di età persistette a lungo; allevati fino a 140 giorni, al momento della fissazione non mostravano più alcuna differenza riconoscibile:

“They were raised to an age of 140 days. On preservation, on Sept. 2, 1914, no difference between them was any longer recognizable.” – (fr:4381-4382) [Furono allevati fino a 140 giorni. Alla fissazione, il 2 settembre 1914, non era più riconoscibile alcuna differenza tra loro.]

Ciò dimostra che un embrione gemello con ⅛ del nucleo zigotico si sviluppa esattamente altrettanto bene quanto uno che ne possiede ¼:

“This shows that a twin embryo with ⅛ of a zygote nucleus developed exactly as well as one having ¼ cleavage nuclei.” – (fr:4383) [Ciò dimostra che un embrione gemello con ⅛ del nucleo zigotico si sviluppò esattamente altrettanto bene di uno avente ¼ dei nuclei di segmentazione.]

La discussione dei risultati chiarisce il significato del piano di costrizione. Quando i primi blastomeri di Triton taeniatus vengono separati da un solco lungo il primo piano di segmentazione, possono entrambi dare embrioni di dimensioni dimezzate ma proporzioni normali, oppure uno solo forma un embrione e l’altro un frammento ventrale privo di organi assiali. Ciò dipende dal fatto che il piano mediano dell’embrione è già determinato e può orientarsi in vario modo rispetto al piano di costrizione:

“This is doubtless connected with the fact that the median plane of the embryo is already determined this early and can have various orientations toward the first cleavage plane and also to the plane of the constriction.” – (fr:4387) [Ciò è senza dubbio connesso al fatto che il piano mediano dell’embrione è già determinato in questa fase precoce e può avere orientamenti diversi rispetto al primo piano di segmentazione e anche al piano di costrizione.]

Se il primo piano di segmentazione coincide con il piano mediano, la costrizione separa metà di uguale potenza e si ottengono gemelli; se invece il piano di segmentazione è frontale (perpendicolare al piano mediano), la metà dorsale produce un embrione, quella ventrale un solo frammento.

Lo stesso fenomeno si osserva costringendo le uova prima della prima segmentazione e separandole completamente dopo la nucleazione della metà ritardata: a seconda dell’orientamento della costrizione si ottengono o gemelli o la coppia embrione-pezzo ventrale. Ciò prova che la costrizione separa talvolta metà di potenza più o meno uguale, talvolta metà di potenza più o meno disuguale:

“Since exactly the same formations, that is, either twins or embryo and ventral piece, arise also from eggs which have been constricted before the appearance of the first cleavage and completely separated into two parts after nucleation of the retarded half, it follows that the constriction sometimes separates halves of more or less equal potency, and sometimes halves of more or less different potency.” – (fr:4391) [Poiché esattamente le stesse formazioni, cioè gemelli oppure embrione e pezzo ventrale, si ottengono anche da uova costrette prima della comparsa della prima segmentazione e separate completamente in due parti dopo la nucleazione della metà ritardata, ne consegue che la costrizione separa talvolta metà di potenza più o meno uguale, talvolta metà di potenza più o meno diversa.]

Il nucleo di segmentazione proveniente da una metà embrionale laterale può quindi iniziare segmentazione e sviluppo normale in una metà fino ad allora enucleata, tanto che l’embrione con nucleazione ritardata può raggiungere la metamorfosi:

“A cleavage nucleus coming from a lateral embryo half, can therefore initiate cleavage and normal development in a hitherto enucleate embryonic half so that the embryo with delayed nucleation can even reach metamorphosis.” – (fr:4393) [Un nucleo di segmentazione proveniente da una metà embrionale laterale può quindi iniziare la segmentazione e lo sviluppo normale in una metà embrionale fino ad allora enucleata, cosicché l’embrione con nucleazione ritardata può addirittura raggiungere la metamorfosi.]

Questo contraddice la teoria di Weismann, secondo cui un tale nucleo dovrebbe contenere solo i corrispondenti frammenti di tutti gli abbozzi degli organi. L’esperimento con costrizione mediana conferma per l’uovo di Triton i risultati di Loeb sul riccio di mare; nel caso della costrizione frontale, invece, i risultati vanno oltre a causa della potenza diseguale delle metà dorsale e ventrale. Formare un embrione richiede una funzione maggiore che formare un frammento ventrale privo di organi assiali, perciò vanno considerati solo i casi in cui la metà dorsale, pur essendo ritardata, produce un embrione normale da un frammento di nucleo di segmentazione, mentre la metà ventrale, malgrado un miglior rifornimento nucleare, non va oltre un frammento ventrale:

“Since the formation of an embryo involves greater function than formation of a ventral fragment without axial organs, we need to take into consideration only the cases where the dorsal half was retarded and yielded a normal embryo out of a fragment of the cleavage nucleus while the ventral half, in spite of having a better nuclear supply, did not proceed beyond the formation of a ventral fragment.” – (fr:4398) [Poiché la formazione di un embrione comporta una funzione maggiore rispetto alla formazione di un frammento ventrale senza organi assiali, dobbiamo prendere in considerazione solo i casi in cui la metà dorsale era ritardata e ha prodotto un embrione normale da un frammento del nucleo di segmentazione, mentre la metà ventrale, malgrado un miglior rifornimento nucleare, non è andata oltre la formazione di un frammento ventrale.]

Il dato cruciale è che la metà ventrale, pur contenendo una porzione maggiore del nucleo zigotico rispetto a quella dorsale, forma sempre meno: la metà dorsale è in grado di formare un embrione sempre con un ottavo e, in certe condizioni, con un sedicesimo del nucleo di segmentazione, mentre per la metà ventrale è inutile possedere quindici sedicesimi o addirittura trentun trentaduesimi, poiché non diventa mai più di un frammento:

“Whereas the dorsal half is capable of forming an embryo always with one-eighth and under certain conditions with one-sixteenth of the cleavage nucleus it is useless for the ventral half to possess fifteen-sixteenths and even thirty-one thirty-seconds of the cleavage nucleus; it never becomes more than a fragment.” – (fr:4400) [Mentre la metà dorsale è capace di formare un embrione sempre con un ottavo e in certe condizioni con un sedicesimo del nucleo di segmentazione, per la metà ventrale è inutile possedere quindici sedicesimi e persino trentun trentaduesimi del nucleo di segmentazione; non diventa mai più di un frammento.]

Questi risultati sanciscono una gerarchia di potenze citoplasmatiche preesistenti alla distribuzione nucleare e indipendenti dalla quantità di materiale nucleare ereditato, segnando un contributo capitale all’affermazione del concetto di sviluppo regolativo contro le ipotesi preformiste.

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[24.1/1-78-4438|4514]

24 Induzione multipla e determinazione del bilanciere negli urodeli: esperimenti di trapianto in Triton e Axolotl

Lo studio indaga, mediante trapianti embrionali, la natura dei fattori induttivi che sovrintendono alla formazione del bilanciere negli anfibi urodeli, evidenziando il ruolo del tetto dell’archenteron, della piastra midollare rostrale e dimostrando che l’assenza dell’organo nell’axolotl risiede in una mancata capacità reattiva dell’epidermide.

L’indagine apre distinguendo la provenienza dei fattori determinanti.
“The factors are situated, or, rather, have originated, in the epidermis.” – (fr:4437) [I fattori sono situati, o piuttosto hanno avuto origine, nell’epidermide.]
Accanto a questi operano fattori collocati nel materiale del tetto dell’archenteron:
“The factors are located in the material of the archenteron roof which underlies the anlage at its determination and which consists of cells destined to form the archenteron of the head and the entomesoderm of the head.” – (fr:4439) [I fattori sono localizzati nel materiale del tetto dell’archenteron che sottende l’abbozzo al momento della sua determinazione, costituito da cellule che formeranno l’archenteron cefalico e l’entomesoderma della testa.]
Infine, la terza categoria di fattori coinvolge elementi della piastra midollare:
“The factors are situated in the elements of the medullary plate which lie close to the balancer, these are especially the eye, behind which the balancer is laid down, the balancer, and the ganglion crest of the head which forms in the medullary ridge and the elements of which later migrate into the lateral walls of the head as ectomesoderm. There they form a large part of the visceral skeleton (Stone).” – (fr:4441‑4442) [I fattori si trovano negli elementi della piastra midollare che sono adiacenti al bilanciere; si tratta specialmente dell’occhio, dietro al quale il bilanciere viene deposto, del bilanciere stesso e della cresta gangliare della testa che si forma nella cresta midollare e i cui elementi migrano più tardi, come ectomesoderma, nelle pareti laterali della testa, dove costituiscono gran parte dello scheletro viscerale (Stone).]

24.1 Il problema della capacità di autodifferenziazione dell’abbozzo ectodermico

Per quanto concerne l’abbozzo ectodermico del bilanciere, gli esperimenti non portano a conclusioni definitive.
“As to (1.): With regard to the ectodermal balancer anlage we have not arrived at any decisive result.” – (fr:4443) [Quanto al punto (1): riguardo all’abbozzo ectodermico del bilanciere non abbiamo raggiunto alcun risultato decisivo.]
I trapianti effettuati da Harrison in stadi di giovane neurula in regioni extra‑cefaliche, nonché i trapianti degli stessi autori nel blastocele della gastrula, danno esito negativo.
“The transplantation by Harrison in early neurula stages in regions outside of the head (Fig. I a, b) and our own transplantation in the blastocoel of the gastrula (Fig. la, c) yielded negative results.” – (fr:4444‑4446) [Il trapianto di Harrison in stadi di giovane neurula in regioni fuori dalla testa (Fig. I a, b) e il nostro trapianto nel blastocele della gastrula (Fig. I a, c) hanno dato risultati negativi.]
Di conseguenza, appare assai dubbio che la capacità di differenziamento autonomo si sviluppi nell’epidermide presuntiva del bilanciere indipendentemente dall’ambiente circostante:
“Thus it appears at least quite doubtful whether the capacity for self‑differentiation develops in the presumptive balancer epidermis independently of the surroundings.” – (fr:4447) [Appare perciò quantomeno assai dubbio che la capacità di autodifferenziamento si sviluppi nell’epidermide presuntiva del bilanciere indipendentemente dall’ambiente.]

24.2 La potente induzione esercitata dal tetto dell’archenteron

Il ruolo del tetto dell’archenteron è inequivocabile.
“As to (2.): If we lift up the anterior half of the head ectodermal plate in an early neurula, remove the underlying archenteric roof, and implant it into the blastocoel of an early gastrula, (Fig. 2a, c) it comes to lie on the ventral side of the embryo during gastrulation, either between epidermis and mesoderm or between mesoderm and endoderm, and it induces a beautiful balancer.” – (fr:4448‑4450) [Quanto al punto (2): se solleviamo la metà anteriore della piastra ectodermica cefalica in una giovane neurula, asportiamo il sottostante tetto dell’archenteron e lo impiantiamo nel blastocele di una gastrula precoce (Fig. 2a, c), esso viene a trovarsi sul lato ventrale dell’embrione durante la gastrulazione, o tra epidermide e mesoderma o tra mesoderma ed endoderma, e induce un bellissimo bilanciere.]
Il bilanciere indotto si sviluppa in sincronia con quello normale e mantiene le stesse proporzioni quando i trapianti sono effettuati tra due embrioni di Triton taeniatus.
“This balancer develops at the same time as the normal one and shares the same sizerelationships as the normal balancer, if the transplantations are carried out between two embryos of Triton taeniatus.” – (fr:4451) [Questo bilanciere si sviluppa contemporaneamente a quello normale e condivide le medesime relazioni di grandezza con il bilanciere normale, se i trapianti sono eseguiti tra due embrioni di Triton taeniatus.]
Pertanto, l’abbozzo del bilanciere è soggetto a un’induzione molto potente da parte del tetto dell’archenteron:
“It is therefore certain that the balancer anlage is subjected to a very powerful induction from the archenteron roof.” – (fr:4453) [È dunque certo che l’abbozzo del bilanciere è sottoposto a un’induzione molto potente dal tetto dell’archenteron.]

24.3 Induzione dalla piastra midollare e principio di “induzione multipla”

Anche gli esperimenti con la piastra midollare offrono risultati positivi. Un quarto cefalico della piastra cefalica, privato del tetto dell’archenteron, trapiantato nel blastocele di una gastrula, contiene presumivo occhio, proencefalo e parte del mesencefalo; se si trapianta anche la cresta midollare, il materiale include la cresta gangliare della testa (ectomesoderma) che dà origine al mesoderma del bilanciere. Tali trapianti inducono primariamente una piastra midollare nell’ectoderma presuntivo e, osservando lo sviluppo successivo, compaiono bilancieri assieme ad altri organi cefalici.
“As to (3.): The experiments with the medullary plate are just as positive. – (fr:4455‑4456) … In these experiments, a cephalic quarter of the head plate without the archenteron roof was transplanted into the blastocoel of a gastrula. The transplant in this case represents presumptive eye, forebrain, and a part of the midbrain. If the medullary ridge is also transplanted, it contains the material of the head ganglion crest, which as ectomesoderm gives rise later, among other things, to the mesoderm of the balancer. Such transplants primarily induce a medullary plate in the presumptive ectoderm. If one observes the further development, balancers also appear among other head organs.” – (fr:4456‑4460) [Negli esperimenti con la piastra midollare (punto 3): un quarto cefalico della piastra cefalica senza tetto dell’archenteron è stato trapiantato nel blastocele di una gastrula. Il trapianto in questo caso rappresenta occhio presuntivo, proencefalo e una parte del mesencefalo. Se si trapianta anche la cresta midollare, esso contiene il materiale della cresta gangliare della testa che, come ectomesoderma, dà origine più tardi, tra l’altro, al mesoderma del bilanciere. Tali trapianti inducono primariamente una piastra midollare nell’ectoderma presuntivo. Se si osserva lo sviluppo successivo, compaiono bilancieri assieme ad altri organi cefalici.]
Solo le regioni più anteriori della piastra midollare possiedono capacità induttiva per il bilanciere, non le posteriori. Tuttavia, nella metà anteriore della piastra cefalica non è stata possibile una localizzazione più precisa. La metà anteriore contiene regioni senza cresta midollare (e quindi senza cresta neurale cefalica e senza mesoderma presuntivo del bilanciere) e regioni anteriori, laterali e caudali all’abbozzo dell’occhio che possiedono capacità induttiva.
“We must accordingly conclude that the capacity to induce a balancer lies in the rostral half of the head plate, without being committed to a specific organ rudiment, such as head ganglion crest, eye, forebrain, or midbrain.” – (fr:4464) [Dobbiamo di conseguenza concludere che la capacità di indurre un bilanciere risiede nella metà rostrale della piastra cefalica, senza essere vincolata a un singolo abbozzo d’organo specifico, come cresta gangliare cefalica, occhio, proencefalo o mesencefalo.]
Tuttavia, il decorso dell’induzione lascia un margine di incertezza. Poiché le strutture indotte producono prima una piastra midollare (con creste e abbozzi oculari) e solo secondariamente il bilanciere, è possibile che la formazione del bilanciere sia indotta dalla piastra cefalica indotta e quindi solo secondariamente dall’impianto.
“It is consequently possible that the formation of the balancer is induced by the induced head‑plate and thus only secondarily by the implant.” – (fr:4467) [È di conseguenza possibile che la formazione del bilanciere sia indotta dalla piastra cefalica indotta e quindi solo secondariamente dall’impianto.]
Per escludere questa catena si è tentata l’induzione del bilanciere senza lo sviluppo preliminare di una piastra midollare secondaria, attaccando un frammento di piastra cefalica all’epidermide ventrale di una gastrula completa (l’epidermide ventrale non forma più una piastra midollare, come dimostrato dai classici esperimenti di Spemann). Finora l’esperimento ha prodotto solo dischi oculari, ma in rari casi si ottengono anche bilancieri. Ciò rende assai probabile un’induzione diretta del bilanciere da parte delle varie porzioni della piastra cefalica rostrale.
“This, it appears to me, makes very likely the direct induction of balancers by the various portions of the rostral head plate.” – (fr:4473) [Ciò, a mio parere, rende molto verosimile l’induzione diretta di bilancieri da parte delle diverse porzioni della piastra cefalica rostrale.]

La sintesi fisiologica indica che la formazione dei bilancieri da parte del mesoderma e dell’epidermide cefalica avviene sotto l’influenza determinante del tetto dell’archenteron e delle parti rostrali della piastra cefalica. Poiché di questi solo la cresta gangliare della testa partecipa materialmente alla costruzione del bilanciere, diversi elementi del vicinato esercitano la loro influenza, garantendo lo sviluppo mediante “induzione multipla”.
“The formation of the balancers by the mesoderm and the epidermis of the head is accomplished, therefore, under the determining influence of the archenteric roof and the rostral parts of the head plate. Since of these probably only the head ganglion crest participates materially in the formation of the balancer, we find that several elements in the neighborhood exert their influence on the balancer; its development is thus assured by ‘multiple induction.’” – (fr:4474‑4475) [La formazione dei bilancieri da parte del mesoderma e dell’epidermide della testa si compie, perciò, sotto l’influenza determinante del tetto dell’archenteron e delle parti rostrali della piastra cefalica. Poiché tra questi probabilmente solo la cresta gangliare della testa partecipa materialmente alla formazione del bilanciere, troviamo che diversi elementi presenti nel vicinato esercitano la loro influenza sul bilanciere; il suo sviluppo è pertanto assicurato da “induzione multipla”.]
L’epidermide presuntiva del bilanciere possiede di per sé una modesta capacità morfogenetica, mentre il punto essenziale è la sua competenza a reagire ai fattori induttivi:
“Presumptive balancer epidermis itself probably has only scant capacity to form balancer; but the essential point is that it can react to inductive factors.” – (fr:4476) [L’epidermide presuntiva del bilanciere ha probabilmente solo una modesta capacità di formare il bilanciere; ma il punto essenziale è che può reagire ai fattori induttivi.]
L’autore ipotizza che altri organi cefalici (naso, vescicole auricolari, branchie) raggiungano lo sviluppo secondo un principio simile, come proveranno ulteriori esperimenti già in corso.

24.4 Il problema dell’assenza del bilanciere nell’axolotl: combinazioni tra Axolotl e Triton

L’axolotl è un urodelo privo di bilanciere; nella posizione corrispondente si trova solo un piccolo arco, che suggerisce un arresto dello sviluppo.
“The axolotl is one of the urodeles which do not develop balancers. In the position of the balancers one finds only a small arch, which suggests that here the development of the balancer does not proceed to completion.” – (fr:4479‑4480) [L’axolotl è uno degli urodeli che non sviluppano bilancieri; nella posizione dei bilancieri si trova solo un piccolo arco, il che suggerisce che qui lo sviluppo del bilanciere non giunga a compimento.]
Per rispondere alla domanda “L’axolotl può indurre un bilanciere?” sono state condotte tre serie di esperimenti.

1. Trapianto di piastra midollare rostrale di axolotl nel blastocele di gastrula di Triton taeniatus: l’induzione cefalica che ne deriva include frequentemente bilancieri. L’embrione di Triton mostra una grossa masserella (impl) sul lato ventrale, distalmente alla quale si forma un bilanciere doppio, assai più grande di quello normale dell’ospite; la masserella contiene gli organi del trapianto e quelli indotti (occhi e cervello).
   “The transplantation of pure rostral medullary plate of axolotl into the blastocoel of the gastrula of Triton taeniatus frequently gives head induction with balancers. Fig. 3 shows such a taeniatus embryo with a large knob (impl) on the side of the belly distal to which there sits a double balancer (H). It is considerably larger than the normal balancer of the host.” – (fr:4483‑4486) [Il trapianto di piastra midollare rostrale pura di axolotl nel blastocele della gastrula di Triton taeniatus dà frequentemente induzione cefalica con bilancieri. La Fig. 3 mostra un embrione di taeniatus con un grosso nodulo (impl) sul lato ventrale, distalmente al quale si trova un bilanciere doppio (H); esso è notevolmente più grande del bilanciere normale dell’ospite.]

2. Trapianto del tetto dell’archenteron rostrale di axolotl nel blastocele di gastrula di Triton: in questo caso compaiono noduli d’impianto con un enorme bilanciere (probabilmente fusione di più bilancieri) o, come dato più tipico, un nodulo con un gran numero di bilancieri di varia taglia. Il tetto dell’archenteron rostrale rivela così un potere induttivo enorme, capace di indurre l’intera epidermide con cui entra in contatto, la quale dapprima si rigonfia in una vescicola e poi produce svariati bilancieri di dimensioni nettamente superiori a quelle normali.
   “The transplantation of rostral archenteron roof of the axolotl neurula into the blastocoel of the gastrula of Triton taeniatus … an implantation knob appeared in the heart region, bearing a huge balancer, which probably is combined out of several balancers. More typical … is the formation of an implantation knob with a great number of balancers of various sizes. … The rostral archenteron roof has, therefore, an enormous power of induction; it induces the whole epidermis it touches.” – (fr:4489‑4490, 4498‑4501) [Il trapianto del tetto dell’archenteron rostrale della neurula di axolotl nel blastocele della gastrula di Triton taeniatus … in un caso è comparso un nodulo d’impianto nella regione cardiaca, portante un enorme bilanciere, probabilmente risultante dalla fusione di più bilancieri. Più tipico … è la formazione di un nodulo d’impianto con un gran numero di bilancieri di varie dimensioni. … Il tetto dell’archenteron rostrale possiede, perciò, un enorme potere di induzione; esso induce l’intera epidermide che tocca.]

3. Trapianto di epidermide presuntiva del tronco di Triton taeniatus nella regione laterale della faccia di una giovane neurula di Axolotl: anche in questo caso il risultato è positivo. L’axolotl riceve l’epidermide di Triton sul lato destro del muso e forma un bel bilanciere, di nuovo notevolmente più grande di quello di una larva di Triton corrispondente; sul lato sinistro, dove l’epidermide è propria dell’axolotl, il bilanciere manca.
   “The transplantation of presumptive trunk epidermis of the early neurula of Triton taeniatus to the lateral facial region of the young neurula of Axolotl likewise yielded positive results. Fig. 4 shows an axolotl larva in ventral aspect; it has taeniatus epidermis on the right side of the face (left in the picture) and has formed a beautiful balancer. On the left side, in the region of the axolotl epidermis, the balancer is missing.” – (fr:4504‑4507) [Il trapianto di epidermide presuntiva del tronco della giovane neurula di Triton taeniatus nella regione facciale laterale della giovane neurula di Axolotl ha dato ugualmente risultati positivi. La Fig. 4 mostra una larva di axolotl in vista ventrale; essa presenta epidermide di taeniatus sul lato destro del muso (a sinistra nell’immagine) e ha formato un bel bilanciere. Sul lato sinistro, dove l’epidermide è propria dell’axolotl, il bilanciere è assente.]

I tre esperimenti dimostrano che nell’embrione di axolotl i poteri induttivi sono presenti. L’induzione può essere diretta, cioè i bilancieri vengono evocati immediatamente e non attraverso la formazione primaria di una “testa” che poi induce il bilanciere, come provano gli ultimi due esperimenti in cui nell’impianto non si sviluppa alcuna piastra midollare. Poiché gli studi su sezione confermano che il mesoderma dell’axolotl partecipa normalmente alla costruzione del bilanciere, l’assenza dell’organo nell’axolotl può risiedere soltanto nella capacità reattiva dell’epidermide.
“Since the mesoderm of the axolotl, as shown by study of sections, participates in a normal manner in the formation of the balancer, the absence of the balancer in the axolotl can only lie in the reaction capacity of the epidermis.” – (fr:4512) [Poiché il mesoderma dell’axolotl, come mostrato dallo studio delle sezioni, partecipa in maniera normale alla formazione del bilanciere, l’assenza del bilanciere nell’axolotl può risiedere unicamente nella capacità reattiva dell’epidermide.]
L’esperimento successivo (4.), solo accennato, servirà a confermarlo.

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[25.1/1-98-4759|4855]

25 L’isolamento dei nuclei cellulari e la scoperta della nucleina

Un resoconto sperimentale sull’estrazione chimica dei nuclei da cellule di pus, che descrive le proprietà di una sostanza ricca di fosforo – la nucleina – gettando le basi per la chimica degli acidi nucleici.

Il testo rappresenta una testimonianza diretta di un momento fondativo della biochimica: il primo isolamento e la caratterizzazione chimica dei nuclei cellulari e del loro costituente principale, la nucleina. L’autore muove dalla premessa che un materiale cellulare puro debba essere il punto di partenza per studiare la costituzione chimica del nucleo (“A material consisting of pure cells like the present one must especially invite an attack upon the problem of the chemical constitution of the cell nucleus” - fr:4759 [Un materiale costituito da cellule pure come quello presente deve particolarmente invitare ad affrontare il problema della costituzione chimica del nucleo cellulare]). Le cellule di partenza, osservate al microscopio, apparivano sferiche, leggermente rigonfie e opache, prive di tracce di decomposizione (fr:4758).

Il lavoro si articola in una serie di tentativi metodologici volti a separare i nuclei dal protoplasma. Inizialmente, l’uso di acido cloridrico molto diluito, capace di dissolvere il protoplasma lasciando nudi i nuclei, diede risultati incompleti: anche dopo giorni di trattamento e ripetuti cambi di liquido, parte del protoplasma aderiva ostinatamente, rendendo la precipitazione incompleta e la filtrazione tediosa (“after several days of treatment, some nuclei were nearly always isolated […] but in the majority of cases some of the protoplasm stubbornly adhered” - fr:4767). L’acido acetico forniva esiti ancora peggiori (fr:4769).

Un approccio meccanico più efficace, sebbene di bassa resa, sfruttava la diversa densità tra nuclei e protoplasma. Trattando le cellule per settimane con acido cloridrico diluito al freddo, agitando vigorosamente il residuo con etere e acqua, si osservava che la massa cellulare con residui protoplasmatici si raccoglieva all’interfaccia tra i due liquidi, mentre sul fondo dello strato acquoso si depositava un fine sedimento polverulento (“At the bottom of the aqueous layer, however, a fine powdery sediment was visible after a time” - fr:4773). Questo sedimento, raccolto su filtro, era costituito da nuclei completamente puri, con contorni lisci, contenuto omogeneo e nucleoli nettamente demarcati, sebbene di volume leggermente ridotto (fr:4775-4776). La separazione si basava verosimilmente sul maggior peso specifico dei nuclei rispetto al protoplasma (fr:4778).

Questi nuclei, inalterati in acqua pura, si rigonfiavano notevolmente in fluidi alcalini molto diluiti, diventando pallidi e perdendo la visibilità dei nucleoli; l’aggiunta di acido ripristinava le condizioni strutturali precedenti (fr:4779-4781). L’estrazione con una soluzione diluita di carbonato di sodio forniva una soluzione giallastra, dalla quale acidi diluiti precipitavano una sostanza fioccosa, insolubile in eccesso di acido ma solubile in minima traccia di alcali caustici o carbonati. Questa sostanza mostrava la reazione xantoproteica con acido nitrico e, con idrossido di sodio e solfato di rame, dava una colorazione blu-violetta, tipica delle proteine, ma si differenziava per la totale mancanza di rigonfiamento o solubilità in acqua neutra, somigliando piuttosto alla mucina di Eichwald (“This substance therefore showed itself to be related to, but not a member of, the proteins” - fr:4788) [Questa sostanza si mostrava quindi imparentata con le proteine, ma non ne faceva parte]. Sul filtro rimaneva inoltre una sostanza insolubile anche in soluzioni concentrate di soda, che dopo essiccamento formava una pellicola simile a collodio, mantenendo al microscopio i contorni di nuclei e nucleoli (fr:4790-4792). Tale pellicola era solubile in HCl concentrato e in alcali caustici, ma resisteva all’acido acetico glaciale a 140°C, suggerendo una somiglianza con la sostanza elastica (fr:4793-4794).

Per ottenere quantità sufficienti di materiale, l’autore ricorse alla digestione con pepsina, già impiegata in chimica delle albumine. Le cellule di pus, pretrattate con alcol caldo per rimuovere la lecitina, venivano digerite a 37-45°C con un estratto filtrato di stomaco di maiale acidificato con HCl fumante. Dopo alcune ore, si separava un sedimento grigio, finemente polverulento, da un fluido giallastro limpido (“Within a few hours a finely powdered gray sediment separated from a clear yellowish fluid” - fr:4801). Prolungando la digestione per 18-24 ore con cambi di liquido, il sedimento risultava composto esclusivamente da nuclei isolati, privi di residui protoplasmatici, sebbene non lisci come quelli isolati con solo acido cloridrico. Mostravano un aspetto raggrinzito, rifrangente, talvolta con ispessimenti irregolari della membrana o una torbidità granulare, e nucleoli visibili nelle forme meno granulose (fr:4811-4815). L’alcol estraeva piccole quantità di una sostanza oleosa, probabilmente lecitina, la cui rimozione era ritenuta responsabile delle alterazioni microscopiche (fr:4826). La massa nucleare così purificata si comportava come i nuclei isolati con HCl diluito: con soda diluita dava un liquido giallo dal quale l’acido acetico precipitava una sostanza insolubile in eccesso di acido, mentre la maggior parte rimaneva indisciolta ma lentamente solubile in alcali caustici (fr:4821-4824).

L’autore distingue provvisoriamente una nucleina solubile e una insolubile, ma osserva che entrambe sono solubili in HCl concentrato e in alcali caustici. Inizialmente, per diluizione o neutralizzazione, quasi tutto il materiale riprecipita; con un’azione prolungata, aumentano i prodotti di trasformazione solubili che non precipitano più, ma possono essere rilevati con tannino. Da ciò trae la supposizione che le due forme non siano essenzialmente diverse, ma modificazioni facilmente interconvertibili (“From this I draw the supposition that soluble and insoluble nuclein are not essentially different, but may be only modifications, easily convertible one into the other” - fr:4839). Sottolinea inoltre che le reazioni simili all’albumina osservate nei filtrati acidi potrebbero derivare da intermedi di trasformazione della nucleina piuttosto che da contaminazioni, ipotizzando la formazione di sostanze albuminoidi o peptono-simili durante la degradazione (fr:4842-4843).

Il resoconto si conclude con un dato analitico fondamentale, nonostante la scarsità di materiale: la sostanza contiene azoto, zolfo ed è particolarmente ricca di fosforo (“The substance contains N, S, and is especially rich in phosphorus” - fr:4851). Questo dato conferiva una base reale alla vecchia tradizione di proteine contenenti fosforo (fr:4852), segnando l’identificazione chimica di quella che sarebbe poi stata riconosciuta come la classe degli acidi nucleici. I dati quantitativi allegati (fr:4854-4855) indicano il peso del campione analizzato, a testimonianza della natura meticolosa e pionieristica del lavoro.

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[26.1/3-95-4904|4997]

26 La dinamica della sostanza nucleare e la divisione cellulare in Salamandra

Resoconto di un’indagine sulla divisione cellulare che, attraverso l’osservazione del vivente e preparati fissati, rivela le trasformazioni strutturali del nucleo, culminando nella scoperta della scissione longitudinale dei filamenti e in un’ipotesi sul loro destino.

Il testo espone un’indagine minuziosa sulla divisione cellulare in larve di salamandra, condotta confrontando osservazioni su tessuto vivente e preparati istologici. L’autore descrive una sequenza di fasi, concentrandosi sull’epitelio delle pinne e sui filamenti branchiali, strutture che si prestano naturalmente all’osservazione senza necessità di sezionamento: “…the gill filaments are as though made to order for obtaining fixed and stained preparations of cell divisions, since no further sectioning or preparation is required.” – (fr:4903) [i filamenti branchiali sono come fatti apposta per ottenere preparati fissati e colorati di divisioni cellulari, poiché non è richiesto alcun ulteriore sezionamento o preparazione]. Per la fissazione vengono prediletti tre reagenti: l’acido picrico, l’acido cromico e, con minore soddisfazione, il cloruro d’oro (fr:4904). L’acido picrico in particolare viene lodato perché consente una successiva colorazione nucleare molto nitida con ematossilina diluita (fr:4905, fr:4906).

L’osservazione parte da un nucleo in riposo per introdurre un concetto fondamentale: la trasformazione della sostanza nucleare. Inizialmente, nel nucleo quiescente, esiste una sostanza fondamentale colorabile, seppur in grado minore rispetto al reticolo e ai nucleoli (fr:4915). Con l’ingresso nella profase (“coil stage”), questa sostanza scompare, venendo incorporata nella parte figurata del nucleo, cioè nei filamenti. “We now assume that this substance is taken over into the formed part of the nucleus, into the network, in preparation for the division” – (fr:4917) [Assumiamo ora che questa sostanza venga assunta nella parte figurata del nucleo, nel reticolo, in preparazione alla divisione]. Questo trasferimento è ritenuto evidente dal fatto che la massa del gomitolo di filamenti in formazione è chiaramente maggiore di quella della struttura nucleare a riposo, e la quantità di colorante che il gomitolo (basket) accumula è stimata pari a quella dell’intero nucleo in riposo, inclusa la sostanza fondamentale (fr:4926). Viene così posta una gerarchia tra un iniziale aspetto finemente granulare del vivente, che si rivela poi, nei preparati colorati, come un fitto intreccio (basketwork) di filamenti spiraliformi (fr:4910, fr:4911). Con la scomparsa dei nucleoli e di ogni sostanza coagulabile in granuli, tutto ciò che è colorabile è ormai assunto negli elementi strutturali (fr:4920).

Durante la seconda fase (“loose coil”), il nucleo si presenta come un delicato intreccio a canestro di filamenti di spessore uniforme e nettamente colorabili, mentre la sostanza fondamentale non trattiene più alcuna traccia di colore (fr:4929, fr:4930). L’autore nota un dato morfometrico preciso: rispetto alla fase precedente, lo spessore dei filamenti è sensibilmente aumentato, mentre la compattezza degli avvolgimenti è diminuita (fr:4934). Per spiegare questa trasformazione, viene scartata l’ipotesi di una fusione di filamenti adiacenti, poiché mancano figure di transizione con spessori parzialmente doppi. La concezione più probabile suggerisce un accorciamento e ispessimento dei filamenti, analogo – ma molto più lento – a una fibra muscolare che si contrae, accompagnato da un loro progressivo spostamento per mantenersi equidistanti (fr:4935, fr:4937).

Il punto di svolta dell’intera indagine emerge con l’osservazione di un fenomeno definito notevolissimo: la scissione longitudinale dei filamenti. “…the threads divide themselves in half lengthwise.” – (fr:4942) [i filamenti si dividono a metà nel senso della lunghezza]. L’autore sottolinea la rilevanza di questa scoperta, che può verificarsi già alla fine dello stadio a gomitolo o durante la terza fase (forma astrale), portando alla compresenza di filamenti singoli e doppi (fr:4943). Viene esclusa con sicurezza l’origine artificiale del fenomeno tramite reagenti, poiché i filamenti doppi sono stati osservati anche nel vivente: “I can rule out every such idea, since I have been fortunate enough in several cases to see the double threads in the living condition as well.” – (fr:4950) [Posso escludere ogni idea del genere, poiché sono stato abbastanza fortunato da vedere i filamenti doppi anche nella condizione vivente]. Lo spessore dimezzato dei filamenti permane come dato costante fino alla fase successiva della piastra equatoriale (fr:4948).

Questa scissione introduce un passaggio ipotetico cruciale sul suo significato. L’autore formula una possibilità senza insistervi, ma ritenendola degna di nota: la divisione longitudinale potrebbe rappresentare una omologia con la separazione in due degli elementi della “piastra nucleare” descritta da Strasburger, Bütschli e O. Hertwig. “one longitudinal half of each thread might move into one half of the nuclear figure, and the other half thread into the other nuclear half, in other words, each into a future daughter nucleus.” – (fr:4961) [una metà longitudinale di ciascun filamento potrebbe spostarsi in una metà della figura nucleare, e l’altra metà nell’altra metà nucleare, in altre parole, ciascuna in un futuro nucleo figlio]. Si ipotizza che, se tutti i filamenti si fossero separati in quattro quarti, nella fase della piastra equatoriale basterebbe un riarrangiamento perché due quarti confluiscano in ciascuna metà nucleare; i contatti tra filamenti all’equatore sarebbero allora fusioni temporanee prive di significato speciale (fr:4962, fr:4964).

Le fasi successive descrivono il ritorno allo stato di riposo attraverso una sequenza inversa. La piastra equatoriale, fase rapida e raramente fissata, è caratterizzata da filamenti disposti parallelamente all’asse di divisione, in uno spazio che comprende da un quinto a un terzo della lunghezza cellulare (fr:4952). Dopo la separazione, i nuclei figli passano da una forma a stella appiattita a una a canestro. Un dato rilevante è l’assenza di uno stadio omogeneo: anche quando il nucleo giovane appare internamente come un ammasso compatto, la colorazione o l’aggiunta di acido acetico rivelano una struttura di bastoncelli irregolari (fr:4977, fr:4978).

Si arriva infine alla costituzione del reticolo dei nuclei figli, che tornano alla condizione di riposo. Durante questo processo, che dura a lungo, il nucleo si ingrandisce lentamente e riacquista una demarcazione netta dal corpo cellulare, mentre la sostanza interstiziale tra i filamenti ridiventa colorabile (fr:4986, fr:4987). L’autore non riesce tuttavia a dimostrare una vera membrana nucleare sostanziale, ipotizzando piuttosto che le parti periferiche del reticolo coalescano in uno strato sottile al confine con il citoplasma (fr:4991). Sul riapparire dei nucleoli, questione giudicata essenziale, non vengono fatte osservazioni dirette, lasciando il punto irrisolto (fr:4993). La conclusione ribadisce che l’intero processo, eccezion fatta per le stelle a doppio filamento, è una sequenza inversa delle trasformazioni subite dal nucleo materno (fr:4997).

[26.2/3-94-4998|5091]

27 La riduzione cromosomica e la sintesi tra citologia e mendelismo

Le osservazioni di van Beneden sulla meiosi in Ascaris e la successiva sintesi di Sutton gettarono le basi per identificare i cromosomi come agenti fisici dell’eredità mendeliana.

Il testo si apre inquadrando il valore storico della monografia di Édouard van Beneden del 1883 sulla maturazione dell’uovo e la fecondazione in Ascaris megalocephala. Viene sottolineato come questo lavoro abbia fornito le basi per chiarire il ruolo dei cromosomi, poiché van Beneden “traced the spermatogenesis and oogenesis of Ascaris megalocephala, and showed that during the p -ocess the chromosome number was reduced to one-half that of the somatic cells” - (fr:5004) [tracciò la spermatogenesi e l’oogenesi di Ascaris megalocephala, e mostrò che durante il processo il numero di cromosomi veniva ridotto alla metà di quello delle cellule somatiche]. Un’ulteriore intuizione cruciale fu che “fertilization brings about a restoration of the diploid chromosome complement” - (fr:5005) [la fecondazione determina il ripristino del complemento cromosomico diploide].

Van Beneden descrive la composizione numerica degli elementi cromatici durante la maturazione dell’uovo con una regolarità sorprendente. Fin dalle prime fasi, la massa cromatica del nucleo dell’uovo è divisa in due porzioni, ciascuna composta da quattro elementi, i quali “are aggregated two by two” - (fr:5009) [sono aggregati due a due]. Questa organizzazione si riflette in tutti gli stadi successivi: nel corpuscolo germinativo, nel primo globulo polare, nel deutialosoma (ovocita secondario) e nel secondo globulo polare, dove si ritrovano costantemente due corpi cromatici costituiti da due o quattro parti. Il culmine di questo processo è la formazione dei pronuclei. Anche qui, “in the female pronucleus there are two chromatic aggregations. Each of these consists of two small chromatic masses each composed of two deeply stained rods” - (fr:5014-5015) [nel pronucleo femminile vi sono due aggregazioni cromatiche. Ciascuna di queste consiste di due piccole masse cromatiche, ognuna composta da due bastoncelli intensamente colorati]. I fenomeni di maturazione nel pronucleo maschile sono descritti come identici.

L’evento centrale della fecondazione è la singolare interazione tra i due pronuclei. Essi si avvicinano al centro dell’uovo, ma “the two pronuclei, without fusing, both participate in the formation of a single dicentric figure” - (fr:5019) [i due pronuclei, senza fondersi, partecipano entrambi alla formazione di una singola figura dicentrica]. Mentre sono ancora perfettamente distinti, subiscono simultaneamente le stesse modificazioni di un nucleo in divisione mitotica. Alla piastra equatoriale, “Each pronucleus furnishes two loops to the chromatic star of the equatorial disc; the star is comprised of two male loops and two female loops” - (fr:5021) [Ciascun pronucleo fornisce due anse alla stella cromatica del disco equatoriale; la stella è composta da due anse maschili e due femminili]. Van Beneden è categorico nell’affermare che “There does not occur at the outset any fusion between the male and female chromatic elements” - (fr:5023) [Non si verifica in alcun momento una fusione tra gli elementi cromatici maschili e femminili], concludendo che la coniugazione dei pronuclei in un nucleo morfologicamente unico non ha luogo.

Da queste osservazioni deriva una nuova definizione di fecondazione. Il momento in cui l’uovo deve considerarsi fecondato coincide con la formazione dei due pronuclei, poiché la loro somma equivale a un nucleo cellulare ordinario e l’uovo si comporta come una singola cellula. Van Beneden concepisce l’uovo e lo spermatozoo come “gonociti”, ovvero mezze cellule: “the male pronucleus proceeds to complete this reduced cell which I call the female gonocyte and to make of it a new complete cell; fertilization aparently consists essentially in this reconstitution of the first embryonic cell” - (fr:5039) [il pronucleo maschile procede a completare questa cellula ridotta che io chiamo gonocita femminile e a farne una nuova cellula completa; la fecondazione apparentemente consiste essenzialmente in questa ricostituzione della prima cellula embrionale]. Questo fenomeno di ricostituzione è intimamente legato al processo di riduzione, ovvero all’espulsione dei globuli polari nell’uovo e delle porzioni citofore nello spermatocita.

Un’osservazione critica per le future teorie dell’ereditarietà riguarda la divisione longitudinale delle anse cromatiche. Van Beneden nota che “the number of loops is constant: one regularly finds four of them” - (fr:5046) [il numero di anse è costante: se ne trovano regolarmente quattro] e che, dividendosi longitudinalmente, ciascuna ansa fornisce metà del proprio materiale a ciascun nucleo figlio. La conclusione ha una portata straordinaria: “each daughter nucleus receives half of its chromatic substance from the spermatozoon, the other from the egg” - (fr:5051) [ciascun nucleo figlio riceve metà della sua sostanza cromatica dallo spermatozoo, l’altra metà dall’uovo]. Se i pronuclei possiedono un carattere sessuale, ne consegue che i nuclei dei primi blastomeri sono ermafroditi. La semplicità del sistema di Ascaris permise a van Beneden di stabilire “the descent of the chromatic substance of cellular nuclei from the male and female gonocytes, the spermatozoon on the one hand and the mature egg on the other” - (fr:5056) [la discendenza della sostanza cromatica dei nuclei cellulari dai gonociti maschile e femminile, lo spermatozoo da un lato e l’uovo maturo dall’altro].

La seconda parte del testo sposta l’attenzione sulla sintesi teorica di Walter S. Sutton, che segna la convergenza tra citologia e mendelismo. Il saggio di Sutton del 1902 viene presentato come la prima sintesi generale che correla le regolarità delle variazioni mendeliane con la meccanica cromosomica osservabile. Il testo ripercorre le scoperte che prepararono il terreno a questa sintesi: la dimostrazione di van Beneden della diploidia dello zigote e dell’aploidia dei gameti; la postulazione e la dimostrazione della riduzione cromosomica nella meiosi; l’osservazione di Henking sull’appaiamento cromosomico come inizio del processo riduttivo; e la conclusione di Montgomery che “the synaptic mates, or conjugant members of a chromosomal pair, are respectively of maternal and paterncd origin” - (fr:5072) [i partner sinaptici, o membri coniuganti di una coppia cromosomica, sono rispettivamente di origine materna e paterna]. Montgomery comprese anche che la meiosi realizzava la disgiunzione degli omologhi, ma non collegò questi fatti alla teoria mendeliana.

Fondamentale fu anche il contributo dell’embriologia sperimentale, in particolare gli studi di Boveri che dimostrarono come uova fecondate da più di uno spermatozoo, contenendo un numero cromosomico anomalo, si sviluppano in embrioni mostruosi. La generalizzazione che ne derivò fu che “mere number of chromosomes does not determine development, but rather each chromosome plays a definite role in normal development” - (fr:5078) [il mero numero di cromosomi non determina lo sviluppo, ma piuttosto ciascun cromosoma gioca un ruolo definito nello sviluppo normale], suggerendo quindi una differenziazione qualitativa tra i cromosomi.

Sutton, partendo da dati puramente citologici ottenuti studiando i cromosomi di Brachystola in varie generazioni cellulari, giunse a una concezione che “completely satisfy the conditions in tipical Mendelian cases” - (fr:5083) [soddisfa completamente le condizioni nei tipici casi mendeliani]. Il principio chiave osservato era duplice: “1. The chromosome group of the presynaptic germ-cells is made up of two equivalent chromosome-series, and that strong ground exists for the conclusion that one of these is paternal and the other maternal.” - (fr:5090-5091) [1. Il gruppo cromosomico delle cellule germinali presinaptiche è costituito da due serie cromosomiche equivalenti, e che esiste una solida base per concludere che una di queste è paterna e l’altra materna. ]. Sebbene il secondo punto sia interrotto nel testo, la direzione del ragionamento è chiara: l’organizzazione del gruppo cromosomico, con la sua doppia serie di origine parentale distinta, fornisce la base fisica per la segregazione dei fattori mendeliani. La citazione di Bateson, che sospettava una corrispondenza tra la simmetria dei risultati mendeliani e una qualche figura simmetrica di distribuzione nelle divisioni cellulari, conferma come l’idea di una relazione tra organizzazione cellulare ed ereditarietà fosse nell’aria, ma fu Sutton a tradurla in una teoria cromosomica coerente.

[26.3/3-94-5092|5185]

28 La formulazione della teoria cromosomica dell’ereditarietà e la determinazione del sesso

Il nucleo del testo descrive la convergenza tra le osservazioni citologiche sulla meiosi e le leggi di Mendel, stabilendo le basi fisiche dell’ereditarietà e affrontando il problema della determinazione del sesso.

Il processo fondamentale è la sinapsi, descritta come “the union in pairs of the homologous members (i. e., those that correspond in size) of the two series” - (fr:5092-5093) [l’unione in coppie dei membri omologhi (cioè quelli che corrispondono per dimensione) delle due serie]. Questa unione è identificata come la base della pseudoriduzione. La divisione cellulare successiva viene distinta in due fasi: la prima mitosi post-sinaptica è equazionale e “hence results in no chromosomic differentiation” - (fr:5095) [quindi non produce differenziazione cromosomica], mentre la seconda è riduzionale, “resulting in the separation of the chromosomes which have conjugated in synapsis, and their relegation to different germ-cells” - (fr:5096) [risultando nella separazione dei cromosomi che si sono coniugati nella sinapsi e nella loro ripartizione in cellule germinali differenti].

Un passaggio cruciale è il superamento dell’ipotesi di purezza parentale dei gameti, secondo cui tutti i cromosomi materni migrano a un polo e quelli paterni all’altro. L’autore inizialmente considerò questa possibilità, ma la riconobbe “at variance with many well-known facts of breeding” - (fr:5100) [in contrasto con molti fatti ben noti dell’allevamento], poiché limiterebbe la variabilità ereditaria a poche combinazioni nella prole. Uno studio più accurato del processo di divisione, inclusivo “of the positions of the chromosomes in the nucleus before division, the origin and formation of the spindle, the relative positions of the chromosomes and the diverging centrosomes, and the point of attachment of the spindle fibers to the chromosomes” - (fr:5107) [delle posizioni dei cromosomi nel nucleo prima della divisione, dell’origine e formazione del fuso, delle posizioni relative dei cromosomi e dei centrosomi divergenti e del punto di attacco delle fibre del fuso ai cromosomi], non fornì alcuna prova a favore di tale purezza. Al contrario, si scoprì che la posizione dei cromosomi bivalenti nella piastra equatoriale della divisione riduzionale “is purely a matter of chance—that is, that any chromosome pair may lie with maternal or paternal chromatid indifferently toward either pole irrespective of the positions of other pairs” - (fr:5109) [è puramente una questione di caso – cioè, che qualsiasi coppia di cromosomi può giacere con il cromatidio materno o paterno indifferentemente verso l’uno o l’altro polo, indipendentemente dalla posizione delle altre coppie].

Questa casualità nell’assortimento genera un numero elevato di combinazioni cromosomiche nei gameti. Per un organismo con 8 cromosomi nelle cellule presinaptiche (4 coppie), i gameti maturi possibili sono 16, non 2, e gli zigoti risultanti dall’incrocio di due individui non imparentati possono presentare 256 combinazioni. La formula generale per il numero di combinazioni nei gameti di un singolo individuo è data come “2^n in which n represents the number of chromosomes in the reduced series” - (fr:5120) [2^n, in cui n rappresenta il numero di cromosomi nella serie ridotta]. Si sottolinea che “in the ordinary form having from 24 to 36 chromosomes, the possibilities are immense” - (fr:5117) [nella forma ordinaria che ha da 24 a 36 cromosomi, le possibilità sono immense]. Se la stima di 16 cromosomi per l’uomo fosse corretta, un singolo individuo produrrebbe 256 tipi di gameti, e una coppia potrebbe generare 536 combinazioni zigotiche; per il riccio di mare Toxopneustes, con 36 cromosomi, le combinazioni possibili nei gameti di un singolo individuo sono 144 e negli zigoti di una coppia salgono a 719.476.736 (fr:5119).

Questa vasta possibilità combinatoria permette di connettere la teoria cromosomica con i fatti noti dell’ereditarietà mendeliana, poiché “Mendel himself followed out the actual combinations of two and three distinctive characters and found them to be inherited independently of one another and to present a great variety of combinations in the second generation” - (fr:5126) [Mendel stesso seguì le combinazioni effettive di due e tre caratteri distintivi e scoprì che venivano ereditati indipendentemente l’uno dall’altro e presentavano una grande varietà di combinazioni nella seconda generazione]. Si stabilisce una corrispondenza esatta tra il comportamento dei cromosomi e quello dei caratteri. Se un ibrido per un carattere (Aa) viene autofecondato, la prole segue la formula AA:2Aa:aa (fr:5131). Applicando lo stesso schema ai cromosomi, un bivalente Aa in sinapsi si separa nei componenti A e a, che passano in gameti diversi. In una forma monoica, i quattro tipi di gameti prodotti (A ♂, a ♂, A ♀, a ♀) si combinano per dare AA, Aa, aA, aa, risultando nel medesimo rapporto fenotipico 1:2:1 (fr:5140). Da ciò deriva che i fenomeni di divisione cellulare e di ereditarietà condividono le stesse caratteristiche essenziali: “purity of units (chromosomes, characters) and the independent transmission of the same” - (fr:5141-5142) [purezza delle unità (cromosomi, caratteri) e la trasmissione indipendente delle stesse].

Il testo affronta poi la relazione tra cromosomi e caratteri, concludendo che un intero cromosoma non può essere la base di un singolo allelomorfo, perché “otherwise the number of distinct characters possessed by an individual could not exceed the number of chromosomes in the germ-products; which is undoubtedly contrary to fact” - (fr:5144) [altrimenti il numero di caratteri distinti posseduti da un individuo non potrebbe superare il numero di cromosomi nei prodotti germinali; il che è indubbiamente contrario ai fatti]. Si assume quindi che un cromosoma sia correlato a molteplici allelomorfi (fr:5145) e che, se i cromosomi mantengono permanentemente la loro individualità, “all the allelomorphs represented by any one chromosome must be inherited together” - (fr:5146) [tutti gli allelomorfi rappresentati da un qualsiasi cromosoma devono essere ereditati insieme].

La seconda parte del testo introduce la questione della determinazione cromosomica del sesso, un problema che all’epoca “remained wholly unexplored” - (fr:5157) [rimaneva del tutto inesplorato] ed era dominato dall’idea che il sesso fosse determinato da condizioni esterne. Vengono descritti due tipi di differenze cromosomiche tra i sessi negli emitteri. Nel tipo A, le cellule della femmina possiedono un cromosoma in più rispetto a quelle del maschio: ad esempio, in Protenor il numero somatico è “14, ♂ 13” - (fr:5181) [14, maschio 13], e nel maschio un cromosoma, l’accessorio o eterotropico, rimane spaiato e passa solo nella metà degli spermatozoi (fr:5184-5185). Nel tipo B, entrambi i sessi hanno lo stesso numero di cromosomi, ma nel maschio uno è molto più piccolo del corrispondente nella femmina (fr:5175). Queste osservazioni fornirono “a visible mechanical basis for the production of males and females in equal numbers and irrespective of external conditions” - (fr:5171) [una base meccanica visibile per la produzione di maschi e femmine in numero uguale e indipendentemente dalle condizioni esterne], dimostrando una disgiunzione di elementi diversi nella formazione dei gameti che rappresenta un fatto, non una teoria (fr:5172).

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29 Dalla deviazione mendeliana alla localizzazione cromosomica dei geni

Il superamento della seconda legge di Mendel attraverso l’evidenza dell’associazione genica e la sua spiegazione meccanica fornita da Morgan.

Il processo di revisione critica delle leggi di Mendel iniziò con la constatazione che i rapporti fenotipici attesi non erano universali. Dati che influenzarono significativamente la generalità della seconda legge furono presentati da Bateson e Punnett nel 1906 “Data significantly affecting the generality of the second law were advanced first by Bateson and Punnett in” - (fr:5225). Nei loro studi pionieristici sui caratteri pollinici del pisello odoroso, i due ricercatori osservarono che le combinazioni geniche entrate nell’ibrido insieme tendevano a rimanere associate durante la formazione dei gameti, come attestato dalla frase “In their pioneer genetical studies of certain pollen characters in sweet peas they found that gene combinations entering the hybrid together tended to remain associated during gamete formation.” - (fr:5226). Il rapporto F2 osservato si discostava significativamente dal classico 9:3:3:1 mendeliano “The F2 ratios which they observed were significantly different from the classical 9:3:3:1” - (fr:5227) e poteva essere spiegato soltanto ipotizzando una serie gametica corrispondente a un rapporto 7:1:1:7 “and could be explained only if the gametic series involved in their formation corresponded to a 7:1:1:7 ratio.” - (fr:5228), mentre l’assortimento indipendente mendeliano richiedeva un rapporto gametico differente “Classical Mendelian independent assortment required a gametic ratio of 1:1:1:1” - (fr:5229, integrato).

Per rendere conto di queste deviazioni, Bateson e Punnett formularono un’ipotesi basata sulla riproduzione differenziale di certe classi gametiche dopo la segregazione “In an attempt to account for these departures Bateson and Punnett hypothesized that following segregation certain gametic classes reproduced more rapidly than others.” - (fr:5229). Questa interpretazione, tuttavia, si rivelò insoddisfacente. Mentre continuavano ad accumularsi casi che verificavano il fatto qualitativo dell’associazione genica, i dati numerici non potevano essere spiegati in modo adeguato dallo schema di Bateson-Punnett “While additional cases verifying the qualitative fact of gene association continued to accumulate in scientific literature, the numerical data could not be explained in any satisfactory fashion by the Bateson-Punnett scheme.” - (fr:5230). A causa di queste inadeguatezze, e poiché divenne presto chiaro che la segregazione avveniva durante la meiosi, la teoria della riproduzione gametica differenziale fu abbandonata “Because of these inadequacies and also because it soon became clear that segregation occurred during meiosis the theory of differential gametic reproduction was abandoned.” - (fr:5231).

La risoluzione di questa impasse è attribuita a T. H. Morgan “The resolution of this impasse in the advancement of modern gene theory is unquestionably credited to T. H. Morgan” - (fr:5232). La sua teoria alternativa del linkage, o associazione, si basa su un principio radicalmente diverso: i geni sono organizzati in un ordine lineare definito all’interno del cromosoma “Morgan’s alternative linkage theory supposes that genes are organized in a definite linear order within the chromosome.” - (fr:5233). Da ciò consegue che geni localizzati sullo stesso cromosoma manifesteranno associazione, mentre se giacciono su cromosomi non omologhi saranno trasmessi secondo il principio dell’assortimento indipendente “Thus, genes are expected to exhibit linkage if they lie within the same chromosome, but, should they lie in nonhomologous chromosomes, they would be transmitted according to the principle of independent assortment.” - (fr:5234). La possibilità di ricombinazione per geni associati dipende dalla rottura dei cromosomi e dal loro riassemblaggio con scambio di segmenti uguali, senza alterazione della sequenza lineare di base “The possibilities of recombination for linked genes were thus envisioned to depend on the breakage of chromosomes and their rejoining in such a way as to result in the exchange of equal segments without disturbance of the basic linear sequence.” - (fr:5235). Su questa teoria, tutti i geni di un organismo dovrebbero ricadere in una serie finita di gruppi di associazione, pari al numero di cromosomi di un assetto aploide “On this theory all the genes of a given organism should fall into a finite series of linkage groups equal in number to the chromosomes comprising a haploid set.” - (fr:5236).

È cruciale notare che la teoria di Morgan, a differenza dell’approccio puramente formalistico di Bateson e Punnett, poggiava solidamente su un corpo accumulato di evidenze citologiche riguardanti il comportamento dei cromosomi durante la profase della prima divisione meiotica “It must be recalled at this point that Morgan’s theory, unlike the purely formalistic approach of Bateson and Punnett, rested solidly upon a body of accumulated cytological evidence concerning the intimate details of chromosome behavior during the prophase of the first meiotic division.” - (fr:5237). La prima verifica di queste assunzioni fu fornita dallo stesso Morgan nel 1911, dimostrando che diversi mutanti legati al sesso in Drosophila erano associati al comportamento dei cromosomi sessuali eteromorfi “The first test of the validity of these assumptions was provided by Morgan (1911) himself when he showed that several sex-linked mutants in Drosophila were associated with the behavior of the heteromorphic sex chromosomes.” - (fr:5238).

Lo stesso Morgan, nel confronto con l’ipotesi di Bateson, offre una spiegazione meccanica semplice. Di fronte ai fatti di “accoppiamento” e “repulsione” tra fattori, dove Bateson ipotizzava complessi sistemi di attrazioni e ordini di precedenza “In place of attractions, repulsions and orders of precedence, and the elaborate systems of coupling, I venture to suggest a comparatively simple explanation…” - (fr:5249), Morgan propone che se i materiali che rappresentano questi fattori sono contenuti nei cromosomi e se quei fattori che “si accoppiano” sono vicini in una serie lineare, durante la coniugazione dei cromosomi parentali regioni omologhe si troveranno opposte “If the materials that represent these factors are contained in the chromosomes, and if those factors that ‘couple’ be near together in a linear series, then when the parental pairs (in the heterozygote) conjugate like regions will stand opposed.” - (fr:5250). La prova del ripiegamento e della separazione su un unico piano spiega che materiali vicini tenderanno a restare sullo stesso lato della divisione, mentre regioni più remote avranno uguale probabilità di finire sullo stesso lato o su quello opposto “In consequence, the original materials will, for short distances, be more likely to fall on the same side of the split, while remoter regions will be as likely to fall on the same side as the last, as on the opposite side.” - (fr:5252). In questo quadro, le proporzioni che risultano non sono l’espressione di un sistema numerico ma della localizzazione relativa dei fattori nei cromosomi “The results are a simple mechanical result of the location of the materials in the chromosomes and of the method of union of homologous chromosomes, and the proportions that result are not so much the expression of a numerical system as of the relative location of the factors in the chromosomes.” - (fr:5255). Invece di una segregazione casuale in senso mendeliano, si trovano “associazioni di fattori” che sono localizzati vicini nei cromosomi, e la citologia fornisce il meccanismo che l’evidenza sperimentale richiede “…we find ‘associations of factors’ that are located near together in the chromosomes. Cytology furnishes the mechanism that the experimental evidence demands.” - (fr:5256-5257).

L’evoluzione del concetto di gene stesso subì una revisione maggiore. Definito originariamente come unità di trasmissione ereditaria con poche proprietà richieste dai principi mendeliani “Originally defined as the unit of hereditary transmission, the gene was thought to possess the few simple properties required by the Mendelian principles.” - (fr:5262), il gene era un’entità la cui definizione era applicabile anche a grandi segmenti o interi cromosomi “This definition was equally applicable to large chromosome segments or to entire chromosomes.” - (fr:5264). La scoperta del crossing-over impose una revisione fondamentale: nel processo di scambio, i geni si comportavano come unità tra le quali, e non attraverso le quali, avvenivano gli scambi “In crossing over genes behaved as units between which, and not through which, exchanges occurred.” - (fr:5266), aggiungendo così una proprietà fondamentale alla loro definizione.

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30 Dalla mutagenesi artificiale alla prova fisica dello scambio genico: due cardini della genetica classica

L’insieme dei brani riunisce le conclusioni di un lavoro sulle mutazioni indotte da raggi X (verosimilmente di H. J. Muller) e la ristampa integrale del celebre articolo di Harriet B. Creighton e Barbara McClintock del 1931, che per la prima volta dimostrò in modo diretto la correlazione fra ricombinazione genetica e scambio fisico di segmenti cromosomici. Ne emerge il passaggio dalla speranza di costruire una “fisiologia del gene” alla concretizzazione di una prova citologica che cambiò il corso della biologia.

Il testo si apre con l’invito rivolto ai genetisti classici a sfruttare i raggi X per ottenere razze artificiali:

“In conclusion, the attention of tho.se working along cla.ssical genetic lines may be drawn to the opportunity, afforded them by the use of X-rays, of creating in their cho.scn organisms a .series of artificial races for use in the study of genetic and “phaenogenetic” |)henomena.” – (fr:5360) [In conclusione, l’attenzione di coloro che operano nell’ambito della genetica classica può essere richiamata sull’opportunità, offerta dall’uso dei raggi X, di creare negli organismi prescelti una serie di razze artificiali da utilizzare nello studio dei fenomeni genetici e “fenogenetici”.]

Questa prospettiva viene immediatamente collegata alla possibilità di indagare la natura materiale del gene:

“riuis we may hope that prob¬ lems of the composition and behavior of the gene can shortly be approached from various new angles, and new haiulles fouiui for their investigation, so that it will be legitimate to speak of the subject of “gene physiology,” at least, if not of gene physics and chem¬ istry.” – (fr:5359) [Così possiamo sperare che i problemi della composizione e del comportamento del gene possano presto essere affrontati da angolazioni nuove e che si trovino nuove leve per la loro indagine, così che sarà legittimo parlare quanto meno di “fisiologia del gene”, se non di fisica e chimica del gene.]

L’autore riconosce che anche altri fattori, oltre ai raggi X, intervengono sulla costituzione del gene e che la misura dei loro effetti, specialmente in combinazione con i raggi X, è praticabile (“I’hc result, however, is enough to indicate that various factors besides X-rays probably do affect the composi¬ tion of the gene, and that the measure¬ ment of their effects, at least when in combination with X-rays, will be prac¬ ticable.” – fr:5358). Se l’effetto mutageno fosse comune alla maggior parte degli organismi, si potrebbero produrre mutazioni “su ordinazione” in numero sufficiente da allestire mappe genetiche soddisfacenti e analizzare contemporaneamente le aberrazioni cromosomiche ottenute (“If, as seems likely on gen¬ eral considerations, the effect is com¬ mon to most organisms, it shouhl be possible to produce, “to order,” enough mutations to furnish respectable ge¬ netic maps, in their selected species, and, by the use of the mapped genes, to ana¬ lyze the aberrant chromo.some phenom¬ ena simultaneously obtained.” – fr:5361).

L’autore accenna a un beneficio per il miglioramento genetico pratico (“Similarly, for the practical breeder, it is hoped that the method will ultimately prove useful.” – fr:5362), ma si mostra cauto riguardo all’uomo (“’J’he time is not ripe to discuss here such po.ssibilities with reference to the human species.” – fr:5363). Il brano si chiude con un ringraziamento al dottor Dalton Richardson, radiologo di Austin, per la somministrazione dei trattamenti con raggi X (fr:5364).

A queste considerazioni fa seguito il testo integrale della memoria di Creighton e McClintock, “A Correlation of Cytological and Genetical Crossing-over in Zea mays”, pubblicata sui Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 17, pp. 492‑497 (1931) (fr:5365‑5368). L’articolo ricostruisce il percorso che portò alla dimostrazione decisiva: già Morgan nel 1911 aveva suggerito che la ricombinazione genetica fosse accompagnata da uno scambio di cromatina tra segmenti equivalenti di cromosomi omologhi, e DeVries aveva avanzato vedute analoghe ancora prima che la meiosi fosse conosciuta (“The relationship between genetic recombination and the occurrence of chromatin exchange between equivalent segments of homologous chrornosotnes at the cytological level was first suggested by Morgan in JQii as an explanation for the genetic phenotnenon of linkage.” – fr:5369; “At an earlier date, and at a time when the details of meiosis were almost wholly unknown, DeVries had speculatively developed a similar view.” – fr:5370). L’ipotesi era stata rafforzata dalla descrizione dei chiasmi da parte di Janssens (fr:5372) e dall’idea che geni disposti linearmente potessero scambiarsi blocchi equivalenti durante la sinapsi (fr:5371). Tuttavia, per vent’anni mancò una prova diretta, principalmente perché due cromosomi omologhi sono morfologicamente identici e non consentono di distinguere l’origine materna da quella paterna dello scambio (“That no such proof was obtained for nearly twenty years is more easily appreciated if it is recalled that two homologous chromosomes are identical even in favorable cytological material under ideal condi¬ tions.” – fr:5374).

La situazione cambiò nel 1931, quando Creighton e McClintock nel mais e, indipendentemente, Stern in Drosophila misero a punto ceppi speciali in cui le due estremità di una coppia di omologhi potevano essere riconosciute al microscopio (“Direct proof that cytological and genetic crossing over was correlated with a physically visible exchange between homologous chromosomes was not achieved until At this time, Creighton and AlcClintock in maize, and independently Stern in Drosophila, developed the tech¬ niques and special stocks essential to the demonstration.” – fr:5376‑5377). Il requisito cruciale era disporre di un cromosoma eteromorfo per marcatori citologici costanti (“The crucial requirement for both methods, which are alike in principle, is the finding or synthesizing of new strains in which the two ends of a particular homologous chromosome pair can be distinguished by readily detectable cytological differences.” – fr:5378).

Nel ceppo di mais analizzato, il cromosoma 9 presentava a un’estremità un grosso ammasso eterocromatico (knob) e all’altra un tratto di cromatina supplementare derivato da una traslocazione reciproca con il cromosoma 8 (“One end of chromosome IX carried a large deeply staining, heterochromatic knob; the other end was marked by an additional length of chromatin due to a previous reciprocal interchange or translocation with chromosome VIII of the regular genome.” – fr:5380). Incrociando piante doppie eterozigoti per il knob e per la traslocazione, si ottenevano, accanto ai due tipi parentali, due nuovi tipi cromosomici, spiegabili soltanto con uno scambio fisico tra i segmenti omologhi (“These could arise only by the occurrence of a physical exchange between the homologous segments.” – fr:5383). Inoltre, il fenomeno era sempre accompagnato da crossing‑over genetico per geni mappati nella regione compresa tra il punto di traslocazione e il knob (“Moreover, this behavior was directly correlated with genetic crossing over for several genes known to be located in the segment be¬ tween the translocation point and the knob.” – fr:5384).

Le popolazioni esaminate da Creighton e McClintock erano numericamente ridotte, ma la correlazione risultò “diretta, decisiva e inequivocabile” (“The populations investigated by Creighton and McClintock were admittedly small, but the correlation between genetic and cytological crossing over was direct, decisive, and unequivocal.” – fr:5385). Il lavoro parallelo di Stern, basato sui cromosomi sessuali di Drosophila, fornì campioni più ampi e una localizzazione più precisa del crossing‑over (fr:5386). Il testo non esita a definire questo esperimento come “una delle esperienze veramente grandi della biologia moderna”, destinato a stimolare ricerca per i successivi venticinque anni tanto quanto era accaduto nel quarto di secolo precedente (“Beyond any question, this is one of the truly great experiments of modern biology, and the conclusion—that pairing chromosomes heteromorphic for two or more regions exchange parts at the same time that they exchange genes assigned to these regions—will doubtless continue to stimulate as much research during the next 25 years as they have during the 25 years following its publication.” – fr:5387).

La parte sperimentale del lavoro illustra la trasmissione del knob come un carattere mendeliano (fr:5391‑5396) e descrive l’assetto prodotto dalla traslocazione 8‑9. In una pianta eterozigote per l’interscambio, durante la meiosi i cromosomi omologhi si appaiano regione per regione; essa forma gameti funzionali soltanto quando riceve l’intero corredo normale (N, n) o l’intero corredo interscambiato (T), generando così quattro tipi cromosomici possibili: knobbed‑interchanged, knobless‑normal (parentali) e knobless‑interchanged, knobbed‑normal (ricombinanti) (“Therefore, it GENETICS should be possible to have crossing-over between the knob and the interchange point.” – fr:5400; “The functional gametes therefore possess either the shorter, normal, knobbed chromo¬ some (n) or the longer, interchanged, knobbed chromosome (/).” – fr:5402; si veda anche Fig. 1, fr:5406‑5413). Incrociando una pianta con corredo misto a piante tester opportune, si potevano riconoscere i quattro tipi citologicamente e misurarne la frequenza. I dati della Tabella 1 (fr:5427‑5431) mostrano che la percentuale di scambio tra il knob e il punto di interscambio è circa il 39% (“’Fhe amount of crossing-oyer be¬ tween the knob and the interchange, as measured from these data, is approxi¬ mately 39%.” – fr:5432).

L’articolo prosegue collegando il knob ai marcatori genetici C (aleurone colorato), sh (endosperma grinzoso) e wx (endosperma ceroso), localizzati sul braccio corto del cromosoma 9 nell’ordine wx‑sh‑c (fr:5433‑5435). In piante eterozigoti per knob e per gli alleli C‑wx/c‑Wx, il crossing‑over in regione 1 (tra knob e C) produce granuli knobless‑C‑wx e knobbed‑c‑Wx; in regione 2 (tra C e wx) produce knobbed‑C‑Wx e knobless‑c‑wx. L’interferenza fa sì che il knob resti associato a C quando avviene un crossing‑over tra C e wx, cosicché i granuli colorati‑amidacei (C‑Wx) portano il knob e quelli incolori‑cerosi (c‑wx) ne sono privi. Sebbene i dati siano pochi, risultano convincenti (“Although the data are few they are con¬ vincing. It is obvious that there is a fairly close association between the knob and C.” – fr:5444).

L’esperimento cruciale impiegò la pianta 338(17), eterozigote per knob, per i geni C e wx e per l’interscambio, incrociata con un tester omozigote knobless c‑Wx/c‑wx. La tabella 3 mostra che tutti i granuli colorati (C) davano piante con il knob, mentre tutti quelli incolori (c) davano piante senza knob (“In this case all the colored kernels gave rise to individuals possess¬ ing a knob, whereas all the colorless kernels gave rise to individuals showing no knob.” – fr:5450). Questo legame prova in modo definitivo che lo scambio genetico fra il knob e il locus C corrisponde a uno scambio fisico visibile al microscopio.

Le percentuali di crossing‑over stimate sono circa il 39% fra knob e punto di traslocazione, il 33% fra c e traslocazione, e il 13% fra wx e traslocazione (fr:5451). L’analisi delle classi fenotipiche (I-IV) mostra che gli individui di classe I sono non‑crossovers, quelli di classe II derivano da crossing‑over in regione 2 senza scambio in regione 1 o 3, mentre la classe III e la IV riflettono situazioni più complesse, anche se i dati rimangono esigui a causa del numero limitato di semi (fr:5453‑5460).

L’intero testo testimonia un passaggio fondamentale: dalla promessa dei raggi X come strumento per fabbricare mutazioni e scandagliare la fisiologia del gene, alla realizzazione concreta della prima dimostrazione citologica del crossing‑over. La convergenza tra l’approccio “fisiologico” e quello citogenetico emerge con chiarezza e segna l’ingresso della genetica in una fase in cui i geni iniziano a essere trattati non più come entità astratte, ma come oggetti materiali di cui si può studiare la composizione e il comportamento meccanico durante la meiosi.

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[29.1/1-119-5496|5613]

31 Controllo genetico delle reazioni biochimiche in Neurospora: un metodo per isolare mutanti metabolici

Una strategia sperimentale rovescia l’approccio classico della fisiogenetica: invece di cercare le basi chimiche di caratteri ereditari noti, si indaga se e come i geni controllino reazioni biochimiche conosciute, utilizzando Neurospora e mutanti indotti da raggi X.

Il testo delinea un programma di ricerca che ha segnato una svolta nella genetica fisiologica, ponendo le basi per l’ipotesi “un gene – un enzima”. L’ipotesi più economica per spiegare il controllo genetico è che “the gene produces its effects by regulating the activity, concentration, or specificity of particular enzymes” – (fr:5495) [il gene produce i suoi effetti regolando l’attività, la concentrazione o la specificità di particolari enzimi]. Tuttavia, “This view does not necessarily imply the existence of any simple one-to-one relationship between the gene and the enzyme” – (fr:5496) [questa visione non implica necessariamente l’esistenza di una semplice relazione uno-a-uno tra gene ed enzima]. Studi recenti su enzimi purificati mostrano infatti che “a single enzyme can be affected by a considerable number of different genes” – (fr:5497) [un singolo enzima può essere influenzato da un numero considerevole di geni diversi]. Dal punto di vista della genetica fisiologica, “the development and functioning of an organism consist essentially of an integrated system of chemical reactions controlled in some manner by genes” – (fr:5498) [lo sviluppo e il funzionamento di un organismo consistono essenzialmente in un sistema integrato di reazioni chimiche controllate in qualche modo dai geni]. È plausibile che i geni stessi, essendo parte del sistema, “control or regulate specific reactions in the system either by acting directly as enzymes or by determining the specificities of enzymes” – (fr:5499) [controllino o regolino reazioni specifiche nel sistema o agendo direttamente come enzimi o determinando la specificità degli enzimi]. Dato che i componenti di tale sistema sono interconnessi in modo complesso, “it would appear that there must exist orders of directness of gene control ranging from simple one-to-one relations to relations of great complexity” – (fr:5500) [sembrerebbe che debbano esistere gradi di controllo genico diretto che vanno da semplici relazioni uno-a-uno a relazioni di grande complessità].

L’approccio tradizionale del fisiogenetista – determinare le basi fisiologiche e biochimiche di caratteri ereditari già noti – aveva stabilito che “many biochemical reactions are in fact controlled in specific ways by specific genes” – (fr:5502) [molte reazioni biochimiche sono effettivamente controllate in modo specifico da geni specifici], come negli studi sui pigmenti antocianici e sulla fermentazione dei lieviti. Queste ricerche tendevano a sostenere che “gene and enzyme specificities are of the same order” – (fr:5503) [le specificità di geni ed enzimi siano dello stesso ordine]. Tuttavia tale approccio presentava limiti intrinseci. Il più grave è che “the investigator must in general confine himself to a study of non-lethal heritable characters” – (fr:5505) [lo sperimentatore deve in generale limitarsi allo studio di caratteri ereditari non letali], i quali coinvolgono per lo più “more or less non-essential so-called ‘terminal’ reactions” – (fr:5506) [reazioni più o meno non essenziali, cosiddette ‘terminali’]. La scelta di questi caratteri aveva alimentato la convinzione, ormai in via di scomparsa, che “genes are concerned only with the control of ‘superficial’ characters” – (fr:5507) [i geni siano coinvolti soltanto nel controllo di caratteri ‘superficiali’]. Una seconda difficoltà, non slegata dalla prima, è che “the standard approach to the problem implies the use of characters with visible manifestations” – (fr:5508) [l’approccio standard al problema implica l’uso di caratteri con manifestazioni visibili], i quali spesso poggiano su “systems of biochemical reactions so complex as to make analysis exceedingly difficult” – (fr:5509) [sistemi di reazioni biochimiche così complessi da rendere l’analisi estremamente difficile].

Per superare questi ostacoli gli autori capovolgono la procedura: invece di lavorare sulle basi chimiche di caratteri genetici noti, si propongono di “determine if and how genes control known biochemical reactions” – (fr:5510) [determinare se e come i geni controllano reazioni biochimiche note]. L’ascomicete Neurospora offre molti vantaggi per un simile approccio ed è adatto agli studi genetici (fr:5511, 5512). Il metodo si fonda sull’assunzione che “x-ray treatment will induce mutations in genes concerned with the control of known specific chemical reactions” – (fr:5513) [il trattamento con raggi X induca mutazioni in geni coinvolti nel controllo di reazioni chimiche specifiche note]. Se un organismo deve compiere una certa reazione per sopravvivere su un dato terreno, un mutante incapace di compierla risulterà letale su quel terreno; tuttavia “such a mutant can be maintained and studied, however, if it will grow on a medium to which has been added the essential product of the genetically blocked reaction” – (fr:5515) [tale mutante può essere mantenuto e studiato se cresce su un terreno a cui sia stato aggiunto il prodotto essenziale della reazione geneticamente bloccata].

Un esempio ipotetico illustra la logica: ceppi normali di Neurospora crassa possono usare saccarosio come fonte di carbonio, quindi compiono l’idrolisi enzimatica di questo zucchero (fr:5517). Assumendo che tale reazione sia sotto controllo genetico, “it should be possible to induce a gene to mutate to a condition such that the organism could no longer carry out sucrose hydrolysis” – (fr:5518) [dovrebbe essere possibile indurre un gene a mutare in una condizione tale che l’organismo non possa più effettuare l’idrolisi del saccarosio]. Il ceppo mutante non crescerebbe su saccarosio ma potrebbe crescere su un’altra fonte di carbonio, come il glucosio, permettendo di rivelare l’incapacità di utilizzare il saccarosio con un semplice trasferimento (fr:5519, 5520). Procedure analoghe possono essere sviluppate per moltissimi processi metabolici, come la sintesi di fattori di crescita (vitamine), amminoacidi e altre sostanze essenziali (fr:5521, 5522). Se le assunzioni sono corrette, “any such metabolic deficiency can be ‘by-passed’ if the substance lacking can be supplied in the medium and can pass cell walls and protoplasmic membranes” – (fr:5523) [qualsiasi carenza metabolica di questo tipo può essere ‘aggirata’ se la sostanza mancante può essere fornita nel terreno e può attraversare pareti cellulari e membrane protoplasmatiche].

Sul piano pratico, gli autori hanno messo a punto una procedura in cui colture da singole spore irradiate sono avviate su un terreno “completo”, contenente “as many of the normally synthesized constituents of the organism as is practicable” – (fr:5524) [il maggior numero possibile dei costituenti normalmente sintetizzati dall’organismo]. Successivamente le colture vengono saggiate trasferendole su un terreno “minimo”, che “requiring the organism to carry on all the essential syntheses of which it is capable” – (fr:5525) [richiede all’organismo di compiere tutte le sintesi essenziali di cui è capace]. Il terreno completo è a base di agar, sali inorganici, estratto di malto, estratto di lievito e glucosio (fr:5526). Il terreno minimo contiene agar (opzionale), sali inorganici, biotina e un disaccaride, grasso o fonte di carbonio più complessa (fr:5527). La biotina, l’unico fattore di crescita che i ceppi selvatici di Neurospora non possono sintetizzare, viene fornita come concentrato commerciale contenente 100 μg di biotina per ml (fr:5528-5529). La composizione della miscela salina usata è quella designata n. 3 da Fries (1938) e comprende NH₄ tartrato, NH₄NO₃, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O, NaCl, CaCl₂, FeCl₃ (fr:5530-5532); il tartrato non è utilizzabile da Neurospora come fonte di carbonio (fr:5533).

Un ceppo che rivela una perdita di capacità sintetica viene individuato dal contrasto di crescita: “is indicated by a strain growing on the first and failing to grow on the second medium” – (fr:5539) [è indicato da un ceppo che cresce sul primo terreno e non sul secondo]. Tali ceppi sono quindi analizzati sistematicamente per determinare quali sostanze non riescono a sintetizzare, saggiando la crescita su terreno minimo addizionato con vitamine note, amminoacidi, o con glucosio al posto della fonte di carbonio complessa (fr:5540-5541).

Da circa 2000 ceppi derivati da ascospore di N. crassa e N. sitophila irradiate prima della meiosi, sono stati individuati tre mutanti che crescono normalmente sul completo e quasi per nulla sul minimo con saccarosio (fr:5542-5543). Il primo, N. sitophila, si è rivelato incapace di sintetizzare la vitamina B₆ (piridossina) – (fr:5544-5545). Il secondo, anch’esso N. sitophila, è risultato “unable to synthesize vitamin B₁ (thiamine)” – (fr:5549) [incapace di sintetizzare la vitamina B₁ (tiamina)], ma più precisamente può sintetizzare la metà pirimidinica della molecola e non la metà tiazolica: “If thiazole alone is added to the minimal medium, the strain grows essentially normally” – (fr:5551) [Se si aggiunge solo il tiazolo al terreno minimo, il ceppo cresce in modo sostanzialmente normale]. Il terzo mutante, N. crassa, è “unable to synthesize para-aminobenzoic acid” – (fr:5553) [incapace di sintetizzare l’acido para-amminobenzoico] e appare del tutto normale quando al terreno minimo viene aggiunto tale composto (fr:5554). Solo per il ceppo “piridossina-less” è stata studiata l’ereditarietà del difetto metabolico indotto (fr:5555).

Il mutante incapace di sintetizzare la piridossina, se coltivato con 1 μg o più di vitamina B₆ sintetica per 25 ml di terreno, “closely approaches in rate and characteristics of growth normal strains grown on a similar medium with no B₆” – (fr:5558) [si avvicina molto, per velocità e caratteristiche di crescita, ai ceppi normali cresciuti su un terreno analogo senza B₆]; concentrazioni inferiori danno tassi di crescita intermedi (fr:5559). Un’indagine quantitativa preliminare è riassunta nella Tabella 1 (fr:5560-5567), che riporta i pesi secchi dei miceli del mutante piridossina-less a varie concentrazioni di B₆: da 0 μg (peso 0 mg) fino a 30 μg (82,4 mg), con un valore di 81,1 mg per il ceppo normale. Gli autori notano che è necessario uno studio più approfondito delle condizioni colturali prima di usare l’incremento ponderale come saggio accurato per la vitamina B₆ (fr:5568-5569).

Un metodo alternativo per misurare la crescita sfrutta il progredire del fronte miceliare in tubi orizzontali di vetro semiriempiti di agar, descritto in dettaglio (fr:5570-5578): tubi di circa 13 mm di diametro interno e 40 cm di lunghezza, con le estremità piegate a 45° e tappate con cotone; l’inoculo è posto a un’estremità e la posizione del fronte avanzante viene registrata nel tempo. “The frontier formed by the advancing mycelia is remarkably well defined, and there is no difficulty in determining its position to within a millimeter or less” – (fr:5579) [Il fronte formato dal micelio in avanzamento è straordinariamente ben definito e non c’è difficoltà a determinarne la posizione con precisione al millimetro o meno]. L’avanzamento è lineare nel tempo e indipendente dalla lunghezza del tubo e dal diametro interno (almeno fino a 9 mm), il che indica che la diffusione dei gas non è limitante (fr:5580-5582). I risultati ottenuti con il mutante piridossina-less a diverse concentrazioni di B₆ sono mostrati nella Fig. 1 e nella Fig. 2. La Fig. 1 (fr:5534-5538) riporta le curve di crescita per il ceppo normale (le due curve superiori) e per il mutante a varie concentrazioni di piridossina (μg/25 ml) in tubi orizzontali; l’ordinata è scalata per ogni curva. La Fig. 2 (fr:5547-5548) illustra la relazione tra tasso di crescita (cm/giorno) e concentrazione di B₆, mostrando che il mutante fornito di B₆ non differisce significativamente dal normale privo di vitamina. “Rate of progression is clearly a function of vitamin B₆ concentration in the medium” – (fr:5584) [La velocità di progressione è chiaramente funzione della concentrazione di vitamina B₆ nel terreno]; si pensa di poter utilizzare il sistema come base per un saggio vitaminico, ma gli autori sottolineano la necessità di ulteriori verifiche di riproducibilità (fr:5588). I risultati sono coerenti con l’ipotesi che “the primary physiological difference between pyridoxinless and normal strains is the inability of the former to carry out the synthesis of vitamin B₆” – (fr:5585) [la differenza fisiologica primaria tra il ceppo piridossina-less e quello normale sia l’incapacità del primo di effettuare la sintesi della vitamina B₆]. Poiché nella biosintesi della B₆ vi è certamente più di un passaggio, “the gene differential involved is presumably concerned with only one specific step in the biosynthesis of vitamin B₆” – (fr:5586) [il differenziale genico coinvolto riguarda presumibilmente un solo passaggio specifico della biosintesi].

L’ereditarietà del carattere “piridossina-less” è stata studiata incrociando ceppi normali e mutanti e isolando le ascospore. Su 24 aschi analizzati, molti non hanno germinato; da sette aschi si sono ottenute spore vitali, cresciute normalmente su terreno ricco (glucosio, estratto di malto e lievito) (fr:5589-5593). I ceppi normali e mutanti sono stati differenziati su terreno carente di B₆: “On this medium the mutant cultures grew very little, while the non-mutant ones grew normally” – (fr:5595) [Su questo terreno le colture mutanti crescevano molto poco, mentre quelle non mutanti crescevano normalmente]. La Tabella 2 (fr:5564-5567) riassume i risultati: nei sette aschi in cui è stata ottenuta germinazione, i caratteri segregano in modo compatibile con l’eredità mendeliana di un singolo gene. Sebbene i dati siano limitati, “this inability to synthesize vitamin B₆ is transmitted as it should be if it were differentiated from normal by a single gene” – (fr:5597) [questa incapacità di sintetizzare la vitamina B₆ è trasmessa come dovrebbe se fosse differenziata dal normale da un singolo gene].

I risultati preliminari suggeriscono che l’approccio possa offrire notevoli promesse per comprendere come i geni regolino sviluppo e funzione (fr:5598). Ad esempio, isolando più mutanti bloccati nello stesso passaggio di una data sintesi, sarà possibile determinare “whether only one gene is ordinarily concerned with the immediate regulation of a given specific chemical reaction” – (fr:5599) [se un solo gene è ordinariamente coinvolto nella regolazione immediata di una specifica reazione chimica]. Dal punto di vista biochimico e fisiologico, il metodo permette di scoprire nuove sostanze essenziali: poiché il terreno completo può essere preparato con estratto di lievito o di Neurospora normale, un mutante che perde la capacità di sintetizzare un composto fornisce un ceppo test per isolarlo (fr:5601). “It may, of course, be a substance not previously known to be essential for the growth of any organism” – (fr:5602) [Può naturalmente trattarsi di una sostanza non precedentemente nota come essenziale per la crescita di alcun organismo]. Così si possono scoprire nuove vitamine e amminoacidi essenziali aggiuntivi (fr:5603). Gli autori segnalano infatti un mutante che cresce su terreno con estratto di lievito ma non sui terreni sintetici finora saggiati, indice di un fattore di crescita del lievito ancora ignoto e indispensabile per Neurospora (fr:5604-5605).

In sintesi, il lavoro delinea una procedura con la quale, usando Neurospora, si possono ottenere e mantenere ceppi mutanti indotti da raggi X caratterizzati dall’incapacità di compiere specifici processi biochimici (fr:5606). Sono stati ottenuti tre mutanti: uno privo della sintesi di vitamina B₆, uno incapace di sintetizzare la frazione tiazolica della tiamina, e uno privo di sintesi di acido para-amminobenzoico (fr:5607-5609). La crescita del mutante piridossina-less è funzione del contenuto di B₆ nel terreno; viene descritto un metodo per misurare la crescita seguendo la progressione lineare del micelio in tubi orizzontali (fr:5610-5611). L’incapacità di sintetizzare la piridossina appare differenziata da un singolo gene (fr:5612). Una nota aggiunta in bozza conferma che anche l’incapacità di sintetizzare tiazolo e acido p-amminobenzoico è ereditata come carattere differenziato da singoli geni (fr:5613).

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32 Dalla teoria della selezione naturale alla sintesi evoluzionistica moderna

Gli eventi e gli scritti qui raccolti delimitano un arco storico che va dalla formalizzazione pubblica della selezione naturale, nel 1858, fino al consolidamento della biologia evoluzionistica intorno alla metà del Novecento. Emergono due nuclei tematici principali: la gestione della priorità scientifica nella comunicazione Darwin-Wallace e una serie di acquisizioni sperimentali e teoriche che hanno integrato genetica, ecologia e datazioni geologiche nella cosiddetta sintesi moderna.

Il primo nucleo è costituito dalla riproduzione della comunicazione presentata alla Linnean Society il 1° luglio 1858, intitolata “On the Tendency of Species to Form Varieties: and on the Perpetuation of Varieties and Species by Natural Means of Selection” (fr:5650). La vicenda che portò a questa seduta è ricostruita in modo puntuale: Charles Darwin, nonostante le insistenti pressioni di Charles Lyell, rimandava la pubblicazione delle proprie idee nell’attesa di raccogliere tutte le prove in un’opera completa. L’impulso decisivo giunse da una lettera di Alfred Russel Wallace, che dalla Malesia inviò un saggio in cui la teoria della selezione naturale era esposta “quasi negli stessi termini di Darwin” (fr:5655). La reazione di Darwin è riportata con una citazione diretta rivelatrice della sua statura intellettuale:

“I never saw a more striking coincidence; if Wallace had had my MS sketch written out in 1842, he could not have made a better short abstract.” – (fr:5656) [Non ho mai visto una coincidenza più sorprendente; se Wallace avesse avuto il mio abbozzo manoscritto stilato nel 1842, non avrebbe potuto fare un estratto breve migliore.]

Darwin si dichiarò pronto a cedere l’onore della priorità, ma l’intervento di Joseph Hooker portò alla presentazione congiunta dei lavori alla Linnean Society, in assenza dello stesso Darwin. La lettera di accompagnamento di Lyell e Hooker, letta il 30 giugno 1858 e riportata nel testo, sancisce ufficialmente la pari dignità dei due naturalisti:

“These gentlemen having, independently and unknown to one another, conceived the same very ingenious theory to account for the appearance and perpetuation of varieties and of specific forms on our planet, may both fairly claim the merit of being original thinkers in this important line of inquiry.” – (fr:5669) [Questi gentiluomini, avendo, indipendentemente e a insaputa l’uno dell’altro, concepito la stessa ingegnosissima teoria per spiegare la comparsa e la perpetuazione delle varietà e delle forme specifiche sul nostro pianeta, possono entrambi giustamente rivendicare il merito di essere pensatori originali in questa importante linea di ricerca.]

La lettera elenca inoltre i materiali presentati, tra cui gli “Estratti da un’opera manoscritta sulle specie, del signor Darwin, abbozzata nel 1839 e copiata nel 1844, quando la copia fu letta dal Dr. Hooker e il suo contenuto successivamente comunicato a Sir Charles Lyell” (fr:5671). Questo documento storico certifica non solo la nascita pubblica della teoria, ma anche la rete di relazioni e il codice d’onore che regolavano la comunità scientifica del tempo.

Il secondo nucleo è una cronologia di avanzamenti della biologia evoluzionistica che copre, indicativamente, gli anni tra il 1930 e il 1954 circa. Essa mostra il progressivo ancoraggio quantitativo e sperimentale della selezione naturale. Accanto all’applicazione della radioattività alla datazione dei minerali, proposta da Boltwood, compare una lunga serie di innovazioni concettuali e metodologiche. Vengono formalizzate le basi matematiche dei cambiamenti evolutivi: le ricerche di Sewall Wright e la pubblicazione di The Genetical Theory of Natural Selection di R. A. Fisher. Parallelamente, la variabilità geografica e il suo significato adattativo sono indagati da Crampton nelle razze di Partula a Tahiti, da Goldschmidt nella Lymantria dispar e da Timofeeff-Ressovsky che misura sperimentalmente la vitalità di ceppi di Drosophila funebris. La dimensione genetica della speciazione emerge in modo spettacolare con l’esperimento di Karpechenko:

“Karpechenko obtained a tetraploid hybrid between the cabbage and the radish, thus creating the new species Raphanobrassica.” – (fr:5639) [Karpechenko ottenne un ibrido tetraploide tra il cavolo e il ravanello, creando così la nuova specie Raphanobrassica.]

La possibilità di studiare la selezione in laboratorio viene rivoluzionata da L’Heritier e Teissier, che “idearono il metodo della “gabbia di popolazione” per lo studio sperimentale della selezione naturale” – (fr:5645), mentre Sumner “mostrò sperimentalmente il valore selettivo della colorazione protettiva nei pesci” – (fr:5646). Il percorso di unificazione culmina con la pubblicazione di Genetics and the Origin of Species di Dobzhansky e con la dimostrazione che mutazioni indotte da raggi X possono generare nuove varietà di cereali agricolamente superiori (fr:5648). Parallelamente, la scala temporale su cui si dispiega l’evoluzione si dilata enormemente: dapprima si stima che l’età della Terra sia “di almeno due miliardi di anni” – (fr:5642), per poi essere portata, con stime riviste, “a cinque-sei miliardi di anni” – (fr:5649). L’insieme di queste voci disegna il passaggio da una teoria fondata sull’osservazione naturalistica a una disciplina sperimentale, quantitativa e molecolarmente orientata.

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33 I documenti di Darwin e Wallace alla Linnean Society (1858)

I testi che gettarono le fondamenta pubbliche della teoria della selezione naturale.

Nell’estate del 1858, Charles Lyell e Joseph D. Hooker presentarono al segretario della Linnean Society tre contributi destinati a mutare radicalmente la storia naturale. La loro comunicazione, datata 30 giugno e letta il 1° luglio, si apriva con la formula “We have the honour to be yours very obediently, Charles Lyell. Jos. D. Hooker.” – (fr:5684-5685) [Abbiamo l’onore di essere vostri obbedientissimi servitori, Charles Lyell, Jos. D. Hooker], e inoltrava a J. J. Bennett un estratto di un’opera inedita di Darwin, il riassunto di una sua lettera al botanico Asa Gray e un saggio di Alfred Russel Wallace. Nei tre brani sono già contenuti, con straordinaria chiarezza, i pilastri della spiegazione evoluzionistica.

Il primo documento, contrassegnato da I. e dall’intestazione “Extract from an unpublished Work on Species, by C. Darwin, Esq., consisting of a portion of a Chapter entitled, ’On the Variation of Organic Beings in a state of Nature; on the Natural Means of Selection; on the Comparison of Domestic Races and true Species” – (fr:5689) [Estratto da un’opera inedita sulle specie, di C. Darwin, consistente in parte di un capitolo intitolato ‘Sulla variazione degli esseri organici allo stato di natura; sui mezzi naturali di selezione; sul confronto tra razze domestiche e specie autentiche’], si fonda sull’idea che la natura sia teatro di una guerra incessante. De Candolle, scrive Darwin, ha dichiarato che tutta la natura è in conflitto, e benché “vedendo il volto sereno della natura, ciò possa a prima vista essere messo in dubbio; ma la riflessione proverà inevitabilmente che è vero” – (fr:5691) [“Seeing the contented face of nature, this may at first well be doubted; but reflection will inevitably prove it to be true.”], la guerra non è costante: ricorre in forma lieve a brevi periodi e diviene più severa a intervalli distanti, tanto che i suoi effetti sfuggono facilmente. Qui la dottrina di Malthus è applicata con forza decuplicata (fr:5693). Ogni specie tende a moltiplicarsi geometricamente, mentre la quantità di cibo rimane in media costante; l’esempio degli uccelli è lampante: “supponete che in un certo luogo vi siano otto coppie di uccelli e che solo quattro di esse allevino ogni anno quattro piccoli … alla fine di sette anni vi saranno 2048 uccelli invece degli iniziali sedici” – (fr:5697) [“Suppose in a certain spot there are eight pairs of birds … at the end of seven years … there will be 2048 birds, instead of the original sixteen.”]. Poiché un simile aumento è impossibile, la stragrande maggioranza dei nati viene eliminata da freni che agiscono in modo differenziato su uova, semi e giovani, e che si fanno estremi durante annate eccezionalmente fredde, calde, secche o umide. Casi concreti lo testimoniano: “durante gli anni dal 1826 al 1828, a La Plata, quando per la siccità morirono milioni di capi di bestiame, l’intera regione brulicò di topi” – (fr:5701) [“during the years 1826 to 1828, in La Plata, when from drought some millions of cattle perished, the whole country actually swarmed with mice.”]. L’attenuazione di un freno, anche minima, scatena le capacità geometriche di accrescimento.

Proprio su questa lotta per l’esistenza si inserisce il meccanismo della selezione naturale. Qualsiasi lieve variazione di struttura, abitudini o istinti che adatti un individuo alle mutate condizioni gli conferisce un vantaggio nella competizione per il cibo o nella difesa. “Il più piccolo granello sulla bilancia, a lungo andare, deve decidere su quale morte cadrà e quale sopravvivrà” – (fr:5718) [“the smallest grain in the balance, in the long run, must tell on which death shall fall, and which shall survive.”]. Per illustrare il processo, Darwin ricorre all’esempio di un cane che su un’isola è spinto a cacciare lepri anziché conigli: “quegli individui con le forme più leggere, gli arti più lunghi e la vista migliore, per quanto minima fosse la differenza, sarebbero leggermente favoriti, e tenderebbero a vivere più a lungo e a sopravvivere nella stagione in cui il cibo è più scarso” – (fr:5720) [“those individuals with the lightest forms, longest limbs, and best eyesight, let the difference be ever so small, would be slightly favoured, and would tend to live longer, and to survive during that time of the year when food was scarcest”]. In mille generazioni la selezione accumulerebbe le differenze, proprio come l’allevatore migliora i levrieri. Nelle piante, se il freno principale agisce sui semi, “quei semi che fossero provvisti di un poco più di piuma, a lungo andare sarebbero disseminati più lontano” – (fr:5724) [“those seeds which were provided with ever so little more down, would in the long run be most disseminated”]. Accanto a questa selezione naturale, Darwin riconosce una seconda agenzia, la selezione sessuale, che scaturisce dalla lotta dei maschi per le femmine e i cui effetti principali riguardano “la modificazione dei caratteri sessuali secondari” – (fr:5730) [“perhaps the effect chiefly produced would be the modification of the secondary sexual characters”].

Il secondo contributo, II., riassume una lettera di Darwin a Asa Gray del settembre Lo sguardo si concentra sul potere della selezione artificiale: “È meraviglioso ciò che può fare il principio della selezione da parte dell’uomo, cioè la scelta di individui con una qualità desiderata e la riproduzione a partire da essi” – (fr:5735) [“It is wonderful what the principle of selection by man, that is the picking out of individuals with any desired quality, and breeding from them, and again picking out, can do.”]. L’accumulo di piccole variazioni – dovute a condizioni esterne o alla semplice non identità tra genitori e prole – permette all’uomo di “adattare gli esseri viventi ai suoi bisogni — si può dire di fare la lana di una pecora buona per tappeti, quella di un’altra per stoffe” – (fr:5743) [“man, by this power of accumulating variations, adapts living beings to his wants—may be said to make the wool of one sheep good for carpets, of another for cloth”]. Se l’uomo, con tutti i suoi limiti, può conseguire tanto in pochi secoli, cosa non potrebbe una selezione che agisce con infallibile costanza per milioni di generazioni? Il tempo necessario è offerto dalla geologia: “Pensate al periodo glaciale, durante il quale le medesime specie di conchiglie sono esistite; devono esserci state milioni e milioni di generazioni” – (fr:5748) [“Think of the Glacial period, during the whole of which the same species at least of shells have existed; there must have been during this period millions on millions of generations.”]. Darwin può così sostenere che esiste “un potere infallibile all’opera nella Selezione Naturale (il titolo del mio libro), che seleziona esclusivamente per il bene di ogni essere organico” – (fr:5750) [“I think it can be shown that there is such an unerring power at work in Natural Selection (the title of my book), which selects exclusively for the good of each organic being.”].

Per spiegare la diversificazione delle specie, Darwin introduce il principio di divergenza: “la stessa superficie supporterà più vita se occupata da forme molto diverse” – (fr:5773) [“The same spot will support more life if occupied by very diverse forms”], e la prole variabile di una specie tenderà a occupare posti differenti nell’economia della natura. “Ogni nuova varietà o specie, una volta formata, generalmente prenderà il posto della sua forma parentale meno adatta, e così la sterminerà” – (fr:5781) [“Each new variety or species, when formed, will generally take the place of, and thus exterminate its less well-fitted parent.”]. Di qui nasce la classificazione naturale, in cui gli esseri organici “sembrano ramificarsi e sotto-ramificarsi come i rami di un albero da un tronco comune, i ramoscelli fiorenti e divergenti che distruggono quelli meno vigorosi—i rami morti e perduti che rappresentano rozzamente generi e famiglie estinti” – (fr:5782) [“organic beings always seem to branch and sub-branch like the limbs of a tree from a common trunk, the flourishing and diverging twigs destroying the less vigorous—the dead and lost branches rudely representing extinct genera and families.”].

Il terzo documento, III., firmato da Alfred Russel Wallace, smonta l’argomento tradizionale secondo cui le varietà domestiche, tendendo a ritornare al tipo originario, proverebbero la stabilità fissa delle specie. Wallace afferma invece che esiste un principio naturale che “farà sì che molte varietà sopravvivano alla specie parentale, e diano origine a variazioni successive che si allontanano sempre più dal tipo originario” – (fr:5794) [“there is a general principle in nature which will cause many varieties to survive the parent species, and to give rise to successive variations departing further and further from the original type”]; la causa risiede nel fatto che la vita degli animali selvatici è una lotta per l’esistenza (fr:5795), che premia ininterrottamente le variazioni vantaggiose.

Letti insieme, i testi depositano davanti alla comunità scientifica la prima formulazione congiunta e pubblica della teoria della selezione naturale. Darwin, congedando la sua lettera a Gray, li definì con modestia: “Questo schizzo è imperfettissimo; ma in uno spazio così breve non posso fare di meglio. La vostra immaginazione deve riempire lacune molto ampie” – (fr:5783-5784) [“This sketch is most imperfect; but in so short a space I cannot make it better. Your imagination must fill up very wide blanks.”]. Quel giorno, tuttavia, le lacune cominciarono a essere colmate da una spiegazione capace di unificare l’intera storia della vita.

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34 Condizioni dell’esistenza, lotta per la sopravvivenza e prime basi quantitative dell’evoluzione

Due contributi che, a distanza di cinquant’anni, fondano la spiegazione ecologica della selezione naturale e il trattamento matematico dell’ereditarietà.

Il primo nucleo del testo, datato «Ternate, February, 1858» (fr:5890), appartiene al saggio in cui Alfred Russel Wallace formula in modo indipendente la teoria della selezione naturale. L’autore muove da un principio ecologico generale: “The full exertion of all their faculties and all their energies is required to preserve their own existence and provide for that of their infant offspring.” – (fr:5796) [Il pieno esercizio di tutte le loro facoltà e di tutte le loro energie è richiesto per preservare la propria esistenza e provvedere a quella della prole.] La possibilità di procurarsi cibo nelle stagioni sfavorevoli e di sfuggire ai nemici costituisce, per Wallace, la condizione primaria che determina l’esistenza di individui e specie (fr:5797). Questi stessi vincoli regolano l’abbondanza delle specie: “by a careful consideration of all the circumstances we may be enabled to comprehend […] what at first sight appears so inexplicable—the excessive abundance of some species, while others closely allied to them are very rare.” – (fr:5798) [con un’attenta considerazione di tutte le circostanze possiamo arrivare a comprendere […] ciò che a prima vista appare così inspiegabile: l’eccessiva abbondanza di alcune specie, mentre altre a loro strettamente affini sono molto rare.]

Wallace stabilisce rapporti generali fra i gruppi animali: i grandi carnivori non possono essere numerosi quanto gli erbivori, le aquile e i leoni mai quanto piccioni e antilopi (fr:5800). Poi mostra che la fecondità ha poco a che fare con l’abbondanza: “Even the least prolific of animals would increase rapidly if unchecked, whereas it is evident that the animal population of the globe must be stationary, or perhaps, through the influence of man, decreasing.” – (fr:5802) [Anche gli animali meno prolifici aumenterebbero rapidamente se non frenati, mentre è evidente che la popolazione animale del globo deve essere stazionaria, o forse, per l’influenza dell’uomo, in diminuzione.] Non si verifica un aumento geometrico anno dopo anno perché esistono freni potenti (fr:5804). Ipotizzando un tasso riproduttivo inferiore alla realtà – ogni coppia di uccelli produce quattro piccoli per quattro volte nella vita – Wallace calcola che in quindici anni una singola coppia arriverebbe a quasi dieci milioni di individui (fr:5805-5807). Poiché ciò non accade, la popolazione deve aver raggiunto il limite e diventare stazionaria poco dopo l’origine della specie (fr:5808). La conseguenza è un’enorme mortalità annuale: “on the lowest calculation the progeny are each year twice as numerous as their parents, it follows that, whatever be the average number of individuals existing in any given country, twice that number must perish annually” – (fr:5809) [al calcolo più basso la prole è ogni anno due volte più numerosa dei genitori; ne consegue che, qualunque sia il numero medio di individui esistenti in un dato paese, ogni anno deve perire il doppio di quel numero].

In questo quadro, le nidiate abbondanti sono superflue per la conservazione della specie: “On the average all above one become food for hawks and kites, wild cats and weasels, or perish of cold and hunger as winter comes on.” – (fr:5811) [In media, tutti tranne uno diventano cibo per falchi e nibbi, gatti selvatici e donnole, o muoiono di freddo e fame all’arrivo dell’inverno.] L’abbondanza di individui non è correlata alla fertilità (fr:5812). L’esempio più notevole è il piccione migratore americano, che depone uno o due uova e alleva generalmente un solo piccolo, eppure è straordinariamente abbondante (fr:5813-5814). La spiegazione sta nella disponibilità costante di cibo su un’area molto vasta e nella capacità di volo rapido e prolungato che permette di spostarsi verso nuove zone di alimentazione non appena una si esaurisce (fr:5816-5817). “This example strikingly shows us that the procuring a constant supply of wholesome food is almost the sole condition requisite for ensuring the rapid increase of a given species, since neither the limited fecundity, nor the unrestrained attacks of birds of prey and of man are here sufficient to check it.” – (fr:5818) [Questo esempio mostra in modo suggestivo che la disponibilità costante di cibo sano è quasi l’unica condizione necessaria per assicurare il rapido aumento di una data specie, poiché né la fecondità limitata né gli attacchi senza freni dei rapaci e dell’uomo sono sufficienti a contenerlo.] La nota dei curatori ricorda che «The passenger pigeon is now extinct» e che l’ultimo esemplare morì nello zoo di Cincinnati nel 1914 (fr:5821-5822).

Il principio si applica a tutti i gruppi. Gli uccelli che non possono migrare quando il cibo scarseggia non raggiungono mai grandi popolazioni; così i picchi sono scarsi in Europa ma abbondanti ai tropici (fr:5824-5825). Il passero domestico supera il pettirosso perché i semi di graminacee si conservano in inverno e le aie forniscono una scorta quasi inesauribile (fr:5826). Gli uccelli marini sono numerosi non per elevata prolificità ma perché le rive brulicano di molluschi e crostacei sempre disponibili (fr:5827-5828). La stessa legge vale per i mammiferi: i gatti selvatici, benché prolifici e con pochi nemici, non raggiungono mai l’abbondanza dei conigli perché il loro cibo è più precario (fr:5829-5831).

In un paese fisicamente immutato la popolazione animale non può aumentare in modo permanente; se una specie cresce, altre che condividono lo stesso cibo devono diminuire (fr:5832-5833). La mortalità annua è immensa, e a soccombere sono i più deboli – i giovanissimi, i vecchi, i malati – mentre sopravvivono gli individui più vigorosi e capaci di procurarsi cibo ed evitare i nemici (fr:5834). È, scrive Wallace, “a struggle for existence” (fr:5835) [una lotta per l’esistenza], nella quale i meno perfettamente organizzati soccombono. Lo stesso processo che opera fra gli individui di una specie agisce fra le specie affini di un gruppo: quelle meglio adatte a ottenere cibo e a difendersi dalle avversità acquistano una superiorità numerica, mentre le altre declinano e, nei casi estremi, si estinguono (fr:5837). Fra questi estremi si collocano tutti i gradi di capacità di preservare la vita, e ciò spiega l’abbondanza o la rarità delle specie (fr:5838). Se conoscessimo perfettamente organizzazione e abitudini di ogni specie, potremmo persino calcolare l’abbondanza proporzionale degli individui (fr:5839).

Stabilite queste due premesse – la stazionarietà della popolazione animale dovuta a penuria periodica di cibo e altri freni, e il fatto che l’abbondanza comparativa dipende interamente dall’organizzazione e dalle abitudini che rendono più o meno difficile procurarsi cibo e sicurezza – Wallace può passare alle varietà (fr:5840). Ogni variazione rispetto alla forma tipica produce un qualche effetto sulle capacità degli individui. Anche un mutamento di colore può influire sulla sicurezza rendendoli più o meno visibili; variazioni più rilevanti, come un aumento di potenza o dimensioni degli arti, influiscono sul modo di procurarsi il cibo o sull’areale (fr:5841-5843). Un’antilope con zampe più corte soccombe più facilmente ai felini; un piccione migratore con ali meno potenti faticherebbe a trovare cibo a sufficienza (fr:5845). Al contrario, una varietà con capacità leggermente superiori di conservare l’esistenza “must inevitably in time acquire a superiority in numbers” – (fr:5846) [deve inevitabilmente acquisire col tempo una superiorità numerica].

Le varietà si dividono perciò in due classi: quelle che non raggiungerebbero mai la popolazione della specie parentale e quelle che col tempo otterrebbero e manterrebbero una superiorità numerica (fr:5849). Se sopravviene un cambiamento ambientale – siccità prolungata, devastazione di vegetazione, arrivo di un nuovo carnivoro – la varietà meno numerosa e più debole soccombe per prima; se la pressione persiste, anche la specie parentale può declinare ed estinguersi, mentre la varietà superiore rimane e, con il ritorno di condizioni favorevoli, occupa il posto delle forme estinte (fr:5850-5852). La varietà ha così sostituito la specie, risultando più altamente organizzata e meglio adattata a prolungare la propria esistenza e quella della razza (fr:5853-5854). Una volta affermatasi, non può tornare alla forma originaria, che è inferiore e non potrebbe competere (fr:5855). Wallace ammette che il processo non è invariabile: mutamenti delle condizioni fisiche potrebbero occasionalmente favorire la vecchia specie o varietà inferiori, e variazioni in parti non importanti potrebbero non avere effetto sulle capacità di sopravvivenza (fr:5859-5860). Tuttavia, su vasta scala, le cause anche minime producono risultati legittimi: “the scale on which nature works is so vast—the numbers of individuals and periods of time with which she deals approach so near to infinity, that any cause, however slight […] must in the end produce its full legitimate results.” – (fr:5862) [la scala su cui opera la natura è così vasta – il numero di individui e i periodi di tempo con cui essa ha a che fare si avvicinano tanto all’infinito – che qualsiasi causa, per quanto lieve […] deve alla fine produrre i suoi pieni e legittimi risultati.]

Il discorso si sposta sugli animali domestici per marcare una differenza essenziale. In natura, benessere ed esistenza dipendono dall’esercizio completo e dalla condizione sana di tutti i sensi e le facoltà fisiche; negli animali domestici queste facoltà sono esercitate solo in parte o restano inutilizzate (fr:5864). “A wild animal has to search, and often to labour, for every mouthful of food—to exercise sight, hearing, and smell in seeking it, and in avoiding dangers, in procuring shelter from the inclemency of the seasons” – (fr:5865) [Un animale selvatico deve cercare, e spesso faticare, per ogni boccone di cibo – esercitare vista, udito e olfatto nel cercarlo e nell’evitare pericoli, nel procurarsi riparo dall’inclemenza delle stagioni]. L’animale domestico ha cibo, riparo e protezione; metà delle sue facoltà è inutile, l’altra metà chiamata in azione solo debolmente e occasionalmente (fr:5867-5868). In questo contesto, qualsiasi variazione che aumenti potenza o capacità in un organo è del tutto inutile e può addirittura passare inosservata (fr:5869). Al contrario, nell’animale selvatico ogni accrescimento diventa immediatamente disponibile, viene rafforzato dall’esercizio e modifica l’economia della razza (fr:5870). “It creates as it were a new animal, one of superior powers, and which will necessarily increase in numbers and outlive those inferior to it.” – (fr:5871) [Crea per così dire un animale nuovo, dotato di poteri superiori, che necessariamente aumenterà di numero e sopravviverà a quelli inferiori.]

Negli animali domestici tutte le variazioni hanno uguale probabilità di conservarsi, anche quelle che in natura sarebbero fatali. Maiali rapidamente ingrassanti, pecore dalle zampe corte, colombi gozzuti e cani barboncini non sarebbero mai potuti sorgere in natura, perché il primo passo verso forme inferiori avrebbe condotto all’estinzione (fr:5872-5873). Se lasciati rinselvatichire, gli animali domestici tornerebbero a un tipo vicino allo stipite selvatico originario o si estinguerebbero (fr:5875-5876). Non si possono quindi trarre inferenze sulle varietà in natura dall’osservazione di quelle domestiche (fr:5877).

Wallace respinge l’ipotesi di Lamarck, secondo cui i cambiamenti progressivi sono prodotti da tentativi degli animali di sviluppare i propri organi. La sua spiegazione rende superflua quell’ipotesi: “the powerful retractile talons of the falcon- and the cat-tribes have not been produced or increased by the volition of those animals; but among the different varieties which occurred in the earlier and less highly organized forms of these groups, those always survived longest which had the greatest facilities for seizing their prey.” – (fr:5881) [i potenti artigli retrattili delle tribù dei falchi e dei gatti non sono stati prodotti o accresciuti dalla volontà di quegli animali; ma tra le diverse varietà comparse nelle forme più antiche e meno organizzate di questi gruppi, sopravvissero sempre più a lungo quelle che avevano le maggiori facilità nell’afferrare la preda.] La giraffa non ha allungato il collo sforzandosi di raggiungere il fogliame; le varietà con collo più lungo ebbero accesso a nuovo pascolo e, durante la prima scarsità di cibo, sopravvissero (fr:5882). I colori mimetici degli insetti si spiegano allo stesso modo: le varietà con tinte meglio adatte a nascondersi sopravvissero più a lungo (fr:5883). Il principio spiega anche l’equilibrio osservato in natura, dove una carenza in un insieme di organi è compensata da un maggiore sviluppo di altri, perché qualsiasi carenza sbilanciata conduce rapidamente all’estinzione (fr:5884-5885).

Questo meccanismo concorda con le linee di divergenza da un tipo centrale, con la crescente efficienza di organi attraverso specie affini e con la persistenza di caratteri secondari come colore e forma di corna (fr:5886). Fornisce inoltre una ragione per la struttura più specializzata delle forme recenti rispetto a quelle estinte, come notato dal professor Owen (fr:5887). In conclusione, esiste in natura una tendenza alla progressione continua di certe varietà, senza limiti definiti, e lo stesso principio che in natura produce questo avanzamento spiega perché le varietà domestiche tendano a tornare al tipo originario (fr:5888). “This progression, by minute steps, in various directions, but always checked and balanced by the necessary conditions, subject to which alone existence can be preserved, may, it is believed, be followed out so as to agree with all the phenomena presented by organized beings, their extinction and succession in past ages, and all the extraordinary modifications of form, instinct, and habits which they exhibit.” – (fr:5889) [Questa progressione, a passi minimi, in varie direzioni, ma sempre frenata e bilanciata dalle condizioni necessarie alle quali soltanto l’esistenza può essere preservata, può, si crede, essere sviluppata in modo da concordare con tutti i fenomeni presentati dagli esseri organizzati, la loro estinzione e successione nelle ere passate, e tutte le straordinarie modificazioni di forma, istinto e abitudini che essi mostrano.]

Il saggio di Wallace porta la data «Ternate, February, 1858». La seconda parte del testo è un breve articolo del matematico britannico G. H. Hardy, pubblicato su Science nel 1908 (fr:5891-5894). Esso entra nel vivo della genetica mendeliana con un chiarimento quantitativo. La premessa è che “Organic evolution consists essentially of long-term changes in the frequency of genes in populations.” – (fr:5895) [L’evoluzione organica consiste essenzialmente in cambiamenti a lungo termine nella frequenza dei geni nelle popolazioni.] Fino ad allora mancavano metodi quantitativi per studiare la genetica delle popolazioni; Hardy, insieme al medico tedesco Weinberg, formulò indipendentemente il principio di equilibrio genetico (fr:5897-5898).

Hardy risponde a un’osservazione di Udny Yule, il quale aveva suggerito che se la brachidattilia è dominante, «in the course of time one would expect, in the absence of counteracting factors, to get three brachydactylous persons to one normal» (fr:5904) [con il passare del tempo ci si aspetterebbe, in assenza di fattori contrastanti, di ottenere tre persone brachidattile per ogni normale.] Hardy dimostra che tale aspettativa è infondata. Assume che una coppia di caratteri mendeliani A (dominante) e a (recessivo) sia presente in una generazione con genotipi AA, Aa, aa nelle proporzioni p:2q:r, e che gli accoppiamenti siano casuali, i sessi equamente distribuiti tra le tre classi e tutti ugualmente fertili (fr:5906). In queste condizioni, la distribuzione delle proporzioni rimane stabile nelle generazioni successive, non tende a un rapporto 3:1. Il principio rappresenta un punto di equilibrio dinamico contro cui misurare gli scostamenti che costituiscono il cambiamento evolutivo (fr:5899). L’articolo di Hardy, per quanto breve e modesto nelle intenzioni, fornisce così la prima pietra del trattamento matematico dell’evoluzione, connettendo la selezione naturale descritta da Wallace con le leggi dell’ereditarietà.

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35 L’evoluzione a ritroso delle catene biosintetiche e l’eredità dell’ambiente chimico primordiale

Il paradosso degli intermedi metabolici privi di funzione autonoma trova una possibile soluzione in un modello di evoluzione per passi successivi inversi, incastonato nella cornice dell’evoluzione chimica prebiotica ipotizzata da Oparin.

Il testo affronta il problema centrale dell’origine di lunghe catene di biosintesi attraverso la selezione naturale. Il nucleo della questione risiede nel fatto che, considerate singolarmente, le sostanze intermedie di una via metabolica non possiedono di per sé un significato fisiologico e la capacità di produrle non conferisce un vantaggio selettivo immediato. “Regarded individually, intermediate substances cannot, in general, be assumed to have physiological significance, and the ability to produce them does not of itself confer a selective advantage” - (fr:5951) [Considerate individualmente, non si può in generale presumere che le sostanze intermedie abbiano un significato fisiologico, e la capacità di produrle non conferisce di per sé un vantaggio selettivo]. Le singole reazioni che compongono la catena acquistano valore per l’organismo solo se considerate collettivamente e in vista del prodotto finale. “The individual reactions making up the chain are of value to the organism only when considered collectively and in view of the ultimate product” - (fr:5950).

L’esempio tratto dalla genetica di Neurospora chiarisce il concetto. Per la sintesi dell’arginina sono noti sette geni differenti, la cui inattivazione di uno qualsiasi impedisce l’intera sintesi. “At the present time seven different genes are known to be concerned in the synthesis of arginine by the mold. The inactivation of any one prevents the synthesis from taking place” - (fr:5953,5954). Due degli intermedi identificati, l’ornitina e la citrullina, a differenza dell’arginina non sono costituenti generali delle proteine e, a parte la loro funzione di precursori, sono apparentemente privi di altra utilità per l’organismo. “Two of the intermediates in the chain have been shown to be the amino acids ornithine and citrulline. Unlike arginine, neither of these substances is a general constituent of proteins. Aside from their function as precursors, they are apparently of no further use to the organism” - (fr:5957-5959). Benché questo rappresenti il caso generale, esistono eccezioni in cui i precursori svolgono funzioni indipendenti. “While the above example probably represents the general case, there are also well-known instances in which precursors serve independent functions” - (fr:5960).

Poiché la selezione naturale non può preservare caratteri non funzionali, l’implicazione più ovvia sembrerebbe essere che un’evoluzione graduale delle biosintesi, tramite la selezione di una mutazione genica singola alla volta, sia impossibile. “Since natural selection cannot preserve non-functional characters, the most obvious implication of the facts would seem to be that a stepwise evolution of biosyntheses, by the selection of a single gene mutation at a time, is impossible” - (fr:5964). Tuttavia, questa non è una conclusione necessaria; in condizioni particolari l’evoluzione graduale di sintesi a catena lunga può verificarsi. “It will be shown below that this is not a necessary conclusion, but that under special conditions the stepwise evolution of long-chain syntheses may occur” - (fr:5965).

Viene innanzitutto considerata un’alternativa: l’origine di una nuova catena di reazioni tramite la combinazione casuale dei geni necessari. “First, however, an alternative to stepwise evolution will be considered; that is, the origin of a new reaction chain through the chance combination of the necessary genes” - (fr:5966). Sebbene la probabilità sia piccola, non è mai zero. Wright ha concluso che tali associazioni casuali possono avere grande importanza evolutiva, specialmente in popolazioni ampie suddivise in molti piccoli gruppi parzialmente isolati. “The breeding structure which most favors this type of evolution is that of a large population divided into many small, partially isolated groups” - (fr:5970). In questi gruppi, la deriva genica casuale assume un ruolo dominante, mentre lo scambio di migranti evita la fissazione di geni deleteri. “As a consequence, a random drift of gene frequencies occurs” - (fr:5973). Se un gruppo trova una combinazione genica favorevole, entra in gioco un processo di selezione intergruppo che diffonde la combinazione all’intera popolazione. “If, by chance, one group finds a particularly favorable combination of genes, a process of intergroup selection comes into play, whereby the favorable combination is spread to the population at large” - (fr:5974). L’efficacia di questo meccanismo diminuisce però in modo approssimativamente esponenziale con l’aumentare del numero di geni richiesti, favorendo l’evoluzione di catene di reazione brevi. “The effectiveness of the process would seem to be strongly dependent on the size of the gene combination required, however, decreasing approximately exponentially with increasing numbers of genes, other factors remaining constant. There would result a tendency toward the evolution of short reaction chains involving the recombination of molecular units already available” - (fr:5977,5978). Inoltre, il modello di Wright è limitato dalla necessità di riproduzione biparentale, mentre è probabile che molte sintesi fondamentali si siano evolute prima della riproduzione sessuale. “The application of Wright’s theory to the particular problem under consideration is limited by the fact that it operates only under biparental reproduction. It is probable that a large number of basic syntheses evolved prior to sexual reproduction” - (fr:5981,5982). La distribuzione universale di composti come amminoacidi, nucleotidi e vitamine del gruppo B testimonia la loro antichissima origine. “The universal distribution among living forms of certain classes of compounds—viz., the amino acids, nucleotides and probably the B vitamins— identifies them as essential ingredients of living matter. The synthesis of these substances must have evolved very early in geologic time, as a necessary condition for further progress” - (fr:5983,5984).

È quindi proposta un’ipotesi speculativa che minimizzi il ruolo del caso e massimizzi quello di forze evolutive dirette. “It is thought that the following suggestion, while definitely a speculation, offers a possible solution along these lines” - (fr:5986). L’idea centrale è che l’evoluzione delle sintesi basilari sia proceduta a ritroso: l’ultimo passaggio della catena fu il primo a essere acquisito, poi il penultimo, e così via. “In essence, the proposed hypothesis states that the evolution of the basic syntheses proceeded in a stepwise manner, involving one mutation at a time, but that the order of attainment of individual steps has been in the reverse direction from that in which the synthesis proceeds—i.e., the last step in the chain was the first to be acquired in the course of evolution, the penultimate step next, and so on” - (fr:5987). Questo processo richiede un ambiente chimico complesso in cui siano disponibili sia i prodotti finali sia i potenziali intermedi. “This process requires for its operation a special kind of chemical environment; namely, one in which end-products and potential intermediates are available” - (fr:5988).

Il meccanismo opera a partire da una specie eterotrofa per una molecola organica essenziale, A, presente nell’ambiente insieme alle sostanze B e C, che possono reagire per dare A. Quando l’attività biologica esaurisce A fino a limitare la crescita, i mutanti capaci di catalizzare la reazione B + C = A godono di un vantaggio selettivo marcato e finiscono per soppiantare il ceppo parentale. “The species is at the outset assumed to be heterotrophic for an essential organic molecule, A. It obtains the substance from an environment which contains, in addition to A, the substances B and C, capable of reacting in the presence of a catalyst (enzyme) to give a molecule of A. As a result of biological activity, the amount of available A is depleted to a point where it limits the further growth of the species. At this point, a marked selective advantage will be enjoyed by mutants which are able to carry out the reaction B + C = A” - (fr:5990-5992). In un ambiente privo di A, una retromutazione diventa letale, fornendo al contempo una teoria per i geni letali. “In the A-free environment a back mutation to the original stock will be lethal, so we have at the same time a theory of lethal genes. The majority of biochemical mutations in Neurospora are lethals of this type” - (fr:5994,5995). Quando anche B diventa limitante, la popolazione si sposta verso un genotipo capace di sintetizzare B da D ed E, costruendo così progressivamente catene più lunghe. “In time, B may become limiting for the species, necessitating its synthesis from other substances, D and E; the population will then shift to one characterized by the genotype (D + E = B, B + C = A)” - (fr:5996). Il modello ammette anche associazioni simbiotiche qualora più intermedi diventino limitanti simultaneamente. “In the event that B and C become limiting more or less simultaneously, another possibility is opened. Under these circumstances symbiotic associations of the type (F + G = C, D + E = B) (F + G = C, D + E = B) will have adaptive value” - (fr:5998,5999).

L’intero costrutto si appoggia sul concetto di un ambiente chimico prebiotico complesso, un corollario necessario all’origine chimica della vita sostenuto da Oparin. È inconcepibile che un’unità autoreplicante complessa come una nucleoproteina abbia avuto origine dalla combinazione casuale di molecole inorganiche; deve essere intercorso un periodo di evoluzione di sostanze organiche di crescente complessità. “The essential point of the argument is that it is inconceivable that a self-reproducing unit of the order of complexity of a nucleoprotein could have originated by the chance combination of inorganic molecules. Rather, a period of evolution of organic substances of ever-increasing degree of complexity must have intervened before such an event became a practical, as distinguished from a mathematical, probability” - (fr:6002,6003). In assenza di organismi viventi a degradarli, sistemi organici altamente complessi poterono svilupparsi, e in questo processo di evoluzione chimica si colloca l’origine della prima nucleoproteina autoduplicante. “He concludes that in the absence of living organisms to destroy them highly complex organic systems can have developed. The first self-duplicating nucleoprotein originated as a step in this process of chemical evolution” - (fr:6006,6007).

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36 L’evidenza della selezione naturale attraverso le variazioni cromosomiche in popolazioni naturali

I gradienti geografici e i cicli stagionali nelle frequenze degli arrangiamenti genici di Drosophila pseudoobscura dimostrano che le inversioni cromosomiche non sono caratteri neutrali, ma risposte adattative modellate dalla selezione naturale.

Le osservazioni sulla coccinella Adalia offrono un primo esempio di cambiamento stagionale delle frequenze geniche. Presso Berlino, “Near Berlin, where the species produces two and possibly three generations per year, the black type increases in relative frequency from about 37 per cent to 59 per cent from spring until autumn.” (fr:6043) [Vicino a Berlino, dove la specie produce due e forse tre generazioni all’anno, il tipo nero aumenta in frequenza relativa da circa il 37% al 59% dalla primavera all’autunno.] Le due forme di colore, nera e rossa, “are known to differ by a single Mendelian gene.” (fr:6042) [È noto che differiscono per un singolo gene mendeliano.] Durante l’inverno la proporzione di neri si riduce a causa di una mortalità differenziale durante l’ibernazione: “Only 4 per cent of black individuals survive hibernation, while about 11 per cent of the reds survive.” (fr:6046) [Solo il 4% degli individui neri sopravvive all’ibernazione, mentre circa l’11% dei rossi sopravvive.] Se ne deduce che il tipo nero è favorito nella stagione calda, ma sfavorito in inverno.

Un caso analogo, ma basato su un carattere non visibile esternamente, è offerto dal moscerino Drosophila. Qui il carattere studiato è l’arrangiamento dei geni nei cromosomi, dovuto quasi interamente a inversioni di segmenti cromosomici (fr:6049‑6050). Diverse specie di Drosophila ospitano nella stessa popolazione più arrangiamenti genici, i cui portatori si incrociano liberamente producendo omozigoti ed eterozigoti per inversione (fr:6051‑6052). Poiché queste differenze non si manifestano nell’aspetto esterno, in passato si riteneva che le inversioni fossero caratteri adattativamente neutri. La svolta avvenne quando Dobzhansky (1943, in D. pseudoobscura) e Dubinin e Tiniakov (1945, 1946, in D. funebris) mostrarono che popolazioni di habitat diversi presentano frequenze differenti degli arrangiamenti genici e che la composizione di una stessa popolazione può variare sensibilmente da stagione a stagione: “Not until Dobzhansky (1943…) and Dubinin and Tiniakov (1945, 1946…) found that populations which live in different habitats often differ in the relative frequencies of their gene arrangements, and that the composition of a single population may vary appreciably from season to season, was it realized that carriers of different gene arrangements may be favored or discriminated against by different environments.” (fr:6054) [Solo quando Dobzhansky (1943…) e Dubinin e Tiniakov (1945, 1946…) scoprirono che popolazioni che vivono in habitat diversi spesso differiscono nelle frequenze relative dei loro arrangiamenti genici e che la composizione di una singola popolazione può variare sensibilmente da stagione a stagione, ci si rese conto che i portatori di diversi arrangiamenti genici possono essere favoriti o sfavoriti da ambienti differenti.] Questi cambiamenti stagionali rappresentano risposte adattative della specie alla successione degli ambienti stagionali e si verificano anche in organismi più longevi, come il criceto Cricetus cricetus, le cui forme nera e agouti variano in frequenza nel tempo e nello spazio a seconda di un singolo gene (fr:6055‑6059).

Il resto del testo è dedicato a Drosophila pseudoobscura, di cui sono noti quindici diversi arrangiamenti genici nel terzo cromosoma. Nessuno di essi è presente nell’intera area di distribuzione della specie, cosicché non esiste un arrangiamento “normale” o “selvatico” (fr:6063‑6064). In molte località convivono fino a sette arrangiamenti e la maggioranza degli individui selvatici è eterozigote per inversione (fr:6065‑6066). Le frequenze relative dei vari arrangiamenti descrivono ogni popolazione e possono differire anche in modo graduale nello spazio, formando gradienti geografici o “cline” (fr:6067‑6070).

La Figura 1 illustra un transetto di circa 1200 miglia attraverso gli Stati Uniti sud‑occidentali. Nelle popolazioni delle Coast Ranges meridionali della California, circa il 50% dei terzi cromosomi possiede l’arrangiamento Standard (ST, colonne nere), ma la frequenza scende al 20‑30% nella Sierra Nevada e nella regione della Valle della Morte, a meno del 5% in Arizona e diventa rara più a est (fr:6072‑6074, 6077). L’arrangiamento Arrowhead (AR, colonne bianche) è frequentissimo in Arizona e Nuovo Messico, tanto che alcune popolazioni locali sembrano omozigoti per esso, mentre la sua frequenza diminuisce sia verso est sia verso ovest, attestandosi intorno al 20% nel Texas centrale e nella California costiera (fr:6078‑6079). L’arrangiamento Pikes Peak (colonne tratteggiate) è comune in Texas e cala rapidamente verso occidente (fr:6080). “Differences in the frequencies of gene arrangements may be observed however between populations which live in localities only a dozen or so miles apart.” (fr:6082) [Differenze nelle frequenze degli arrangiamenti genici possono tuttavia essere osservate tra popolazioni che vivono in località distanti solo una dozzina di miglia o poco più.]

Sul Monte San Jacinto in California, tre località distanti 10‑15 miglia e poste a differenti altitudini — Keen Camp (4500 piedi, fascia a pino ponderosa), Pinon Flats (4000 piedi, pineta più arida) e Andreas Canyon (800 piedi, margine desertico) — mostrano gradienti altitudinali (fr:6083‑6085). La Tabella 1 riporta le frequenze: ST è più frequente nella località più bassa (Andreas, 57,6%) e meno in quella più alta (Keen, 33,7%); CH (Chiricahua) segue l’andamento opposto (25,1% a Keen, 38,0% a Pinon, 15,3% ad Andreas), mentre AR non presenta differenze significative (fr:6088‑6091, dati dalla tabella). “Altitudinal gradients in the frequencies of gene arrangements suggest that the differences between the inhabitants of different elevations on the same mountain range are adaptive and are produced by natural selection.” (fr:6101) [I gradienti altitudinali nelle frequenze degli arrangiamenti genici suggeriscono che le differenze tra gli abitanti di diverse altitudini sulla stessa catena montuosa siano adattative e prodotte dalla selezione naturale.]

Campionamenti ripetuti sul Monte San Jacinto hanno inoltre rivelato cicli stagionali regolari. A Pinon Flats (Figura 2) in primavera (marzo) la popolazione contiene circa il 50% di ST e poco più del 20% di CH. “From March to June the frequency of ST declines to less than 30 per cent and that of CH increases to just below 40 per cent. During the summer, from June to September, the reverse change takes place, namely ST increases in frequency, and CH decreases, to about the same values which these gene arrangements had during the spring.” (fr:6110‑6111) [Da marzo a giugno la frequenza di ST scende a meno del 30% e quella di CH sale a poco meno del 40%. Durante l’estate, da giugno a settembre, avviene il cambiamento inverso: ST aumenta di frequenza e CH diminuisce, raggiungendo all’incirca gli stessi valori che questi arrangiamenti genici avevano in primavera.] AR segue grossomodo lo stesso percorso di CH, mentre l’arrangiamento Tree Line non mostra cambiamenti regolari (fr:6112, 6117). Simili oscillazioni sincronizzate con le stagioni si osservano ad Andreas Canyon, dove nei mesi caldi le mosche sono scarse ma al ritorno delle popolazioni in settembre ST ha già recuperato le alte frequenze e CH si è ridotto (fr:6118‑6122).

Singolarmente, a Keen Camp non si rilevano fluttuazioni mensili statisticamente significative, nonostante i campionamenti coprano da aprile a ottobre (fr:6123‑6125). In questa località si è invece manifestato un trend pluriennale non ciclico: dal 1939 al 1946 la frequenza di ST è salita dal 28% al 50%, mentre AR è scesa dal 30% al 15% e CH dal 38% al 28% circa (fr:6126‑6130).

L’insieme di queste osservazioni — gradienti geografici su larga e piccola scala, cicli stagionali ricorrenti e tendenze a lungo termine — costituisce una testimonianza diretta di come le frequenze degli arrangiamenti cromosomici rispondano in modo dinamico e prevedibile alle pressione selettive imposte dall’ambiente, confermando il loro ruolo adattativo e smentendo l’ipotesi di neutralità che aveva prevalso fino agli anni Quaranta.

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37 La selezione naturale come causa dei cambiamenti ciclici: dai dati di campo agli esperimenti di laboratorio in Drosophila pseudoobscura

L’analisi delle variazioni nelle frequenze dei riarrangiamenti genici in popolazioni naturali di Drosophila pseudoobscura conduce all’ipotesi della selezione naturale come fattore causale primario, un’ipotesi poi verificata sperimentalmente tramite l’uso di gabbie di popolazione che hanno rivelato un vantaggio selettivo degli eterozigoti e l’instaurarsi di equilibri stabili.

Il testo affronta il problema delle variazioni cicliche nella composizione genetica di popolazioni naturali del moscerino Drosophila pseudoobscura e la dimostrazione sperimentale che tali variazioni sono il prodotto della selezione naturale. L’argomentazione si sviluppa a partire da un’osservazione problematica: la presenza di cambiamenti ciclici stagionali e non stagionali non è un fenomeno universale. Infatti, “No such directional trends of change have appeared at Pinon Flats or at Andreas Canyon, although statistically significant differences in the composition of the populations from year to year have been recorded also in these localities” - (fr:6131) [Non sono comparsi simili trend direzionali di cambiamento a Pinon Flats o ad Andreas Canyon, sebbene anche in queste località siano state registrate differenze statisticamente significative nella composizione delle popolazioni di anno in anno.]. Questa eterogeneità rende ogni generalizzazione affrettata, poiché “the fact that cyclic changes occur at Pinon Flats and at Andreas Canyon, but not at Keen Camp only some 15 miles away, makes generalizations at this time decidedly premature” - (fr:6133) [il fatto che i cambiamenti ciclici si verifichino a Pinon Flats e ad Andreas Canyon, ma non a Keen Camp a sole 15 miglia di distanza, rende le generalizzazioni in questo momento decisamente premature.]. Ciononostante, dati provenienti dal Texas centrale confermano l’esistenza di cambiamenti ciclici stagionali, coinvolgendo in quel caso gli arrangiamenti genici Arrowhead e Pikes Peak del terzo cromosoma (fr:6134, 6135).

L’ipotesi avanzata per spiegare la natura regolare e ciclica dei cambiamenti osservati, ad esempio sul Monte San Jacinto, è che la selezione naturale ne sia la causa prima. Il meccanismo è descritto in termini di successo riproduttivo differenziale: “If during the spring the carriers of CH chromosomes leave more surviving progeny on the average than the carriers of ST chromosomes, then the frequency of CH will increase and that of ST will decrease. This is what happens from March to June” - (fr:6139, 6140) [Se durante la primavera i portatori dei cromosomi CH lasciano in media più progenie sopravvissuta rispetto ai portatori dei cromosomi ST, allora la frequenza di CH aumenterà e quella di ST diminuirà. Questo è ciò che accade da marzo a giugno.]. L’inversione del trend durante l’estate suggerisce un vantaggio riproduttivo rovesciato dei portatori di ST rispetto a quelli di CH nell’ambiente estivo (fr:6141). L’assenza di cambiamenti durante l’autunno e l’inverno ad Andreas Canyon viene invece interpretata come un’equivalenza adattativa dei diversi tipi cromosomici in quelle stagioni (fr:6142).

Una difficoltà argomentativa sorge dalla rapidità dei cambiamenti osservati, un dettaglio quantitativo che solleva dubbi sulla plausibilità della selezione naturale come spiegazione. La portata del fenomeno è notevole: “Indeed, at Pinon Flats the frequency of ST chromosomes falls from about 50 per cent in March to 28 per cent in June, and increases again to about 48 per cent in September” - (fr:6144) [Infatti, a Pinon Flats la frequenza dei cromosomi ST scende da circa il 50 per cento in marzo al 28 per cento in giugno, e aumenta di nuovo a circa il 48 per cento in settembre.]. Poiché “Drosophila is a rapidly breeding insect, time intervals such as these can correspond to at most two to four generations” - (fr:6145) [la Drosophila è un insetto a rapida riproduzione, intervalli di tempo come questi possono corrispondere al massimo a due-quattro generazioni.], le forze selettive necessarie per produrre mutamenti tanto rapidi dovrebbero essere molto intense. L’autore controbatte a questa obiezione mettendo in discussione un pregiudizio diffuso: “The wide-spread opinion that these forces are generally weak, and their effects negligible except in terms of quasi-geological time is only an opinion and has no basis in factual data” - (fr:6147) [L’opinione diffusa che queste forze siano generalmente deboli e i loro effetti trascurabili se non in termini di tempo quasi geologico è solo un’opinione e non ha alcuna base in dati fattuali.]. Trovare grandi pressioni selettive in popolazioni naturali può essere inaspettato, ma non intrinsecamente impossibile (fr:6148).

Il testo riconosce tuttavia un limite epistemologico: “the occurrence of changes does not in itself prove that they are produced by natural selection” - (fr:6149) [il verificarsi di cambiamenti non prova di per sé che essi siano prodotti dalla selezione naturale.]. Procurarsi una prova del genere dalle sole osservazioni di popolazioni naturali sarebbe molto difficile, anche perché le conoscenze sulle esigenze di cibo e riparo di D. pseudoobscura nei suoi habitat naturali sono ancora assai lacunose (fr:6150, 6151). Questa difficoltà rende impraticabile un metodo di prova analogo a quello usato da Timofeeff-Ressovsky in Adalia, ma spiana la strada a un progetto più ambizioso: “to demonstrate the occurrence of natural selection by means of laboratory experiments” - (fr:6153) [dimostrare il verificarsi della selezione naturale per mezzo di esperimenti di laboratorio.].

Lo strumento tecnico per questa dimostrazione è la gabbia di popolazione, una modifica del dispositivo ideato da L’Héritier e Teissier. Le gabbie sono descritte come scatole di legno con pareti di vetro o rete metallica e un coperchio di vetro rimovibile; il fondo presenta quindici aperture circolari chiuse da tappi che reggono contenitori di vetro con il terreno di coltura (fr:6154-6157). Inizialmente vengono introdotte nella gabbia diverse centinaia di mosche, una miscela di individui con diversi arrangiamenti genici in proporzioni desiderate. In una singola generazione, la popolazione raggiunge il massimo compatibile con la quantità di cibo disponibile, solitamente tra le duemila e le quattromila mosche (fr:6158-6161). La competizione per la sopravvivenza è intensa, poiché “the numbers of eggs deposited in a population cage are tens to hundreds of times greater than the numbers of adult flies that hatch” - (fr:6162) [il numero di uova deposte in una gabbia di popolazione è da decine a centinaia di volte maggiore del numero di mosche adulte che si schiudono.]. Per monitorare l’evoluzione dell’esperimento, a cadenza mensile o ad altri intervalli opportuni vengono prelevati campioni di uova e le larve che ne emergono vengono allevate in normali bottiglie di coltura, esaminandone poi i cromosomi delle ghiandole salivari (fr:6164, 6165). Un dettaglio metodologico importante è che la popolazione iniziale di ogni gabbia è composta da una miscela di diversi ceppi per ciascun tipo di inversione, in modo da garantire l’eterogeneità genetica e rendere relativamente rari gli omozigoti per un singolo cromosoma individuale; l’interesse è rivolto al valore selettivo degli arrangiamenti ST, AR e CH come classi, non agli effetti di singoli cromosomi (fr:6167-6170).

I risultati di ventinove esperimenti condotti con popolazioni i cui cromosomi derivavano da antenati raccolti a Pinon Flats rivelano un quadro a due facce. Da un lato, “at 16½° C. no significant changes in the frequencies of the gene arrangements have taken place. The relative frequencies present in the original population of the cage have been retained generation after generation” - (fr:6175, 6176) [a 16½° C. non si sono verificati cambiamenti significativi nelle frequenze degli arrangiamenti genici. Le frequenze relative presenti nella popolazione originale della gabbia sono state mantenute generazione dopo generazione.]. Dall’altro lato, a 25° C. o a temperature ambiente, le proporzioni relative degli arrangiamenti genici sono cambiate nel tempo fino al raggiungimento di proporzioni di equilibrio definite (fr:6177).

Un esempio emblematico è fornito dalla gabbia di popolazione n. 35, in cui una popolazione iniziale con il 10,7% di ST e l’89,3% di CH ha visto la frequenza di ST raddoppiare in circa un mese, triplicare all’inizio di maggio e quasi quadruplicare all’inizio di giugno, fino a raggiungere il 66,7% a metà novembre e il 71,0% a fine dicembre (fr:6178-6182). Il dato cruciale è che “ST chromosomes never supplant entirely CH chromosomes. The final result of selection is a stable mixture of both ST and CH chromosomes” - (fr:6183, 6184) [i cromosomi ST non soppiantano mai interamente i cromosomi CH. Il risultato finale della selezione è una miscela stabile di entrambi i cromosomi ST e CH.].

L’analisi matematica condotta da Wright conclude che l’ipotesi più semplice per spiegare i dati è che il valore adattativo più alto risieda negli eterozigoti ST/CH, mentre entrambe le classi omozigoti, ST/ST e CH/CH, sono inferiori agli eterozigoti, con ST/ST superiore a CH/CH (fr:6186, 6187). La curva teorica calcolata assumendo valori adattativi di 0 per ST/CH, 7 per ST/ST e 4 per CH/CH, con una generazione della durata media di un mese, si adatta ai valori osservati in modo notevolmente preciso (fr:6188, 6189). Con questi valori, l’equilibrio atteso si colloca intorno al 67% ST e 33% CH, e tutti gli esperimenti condotti a temperature superiori ai 20° C. hanno condotto a equilibri prossimi al 70% ST e 30% CH (fr:6192-6194). La gerarchia dei valori adattativi per le diverse combinazioni segue pattern coerenti: per ST e AR, ST/AR > ST/ST > AR/AR; per AR e CH, AR/CH > AR/AR > CH/CH. Esperimenti con miscele dei tre arrangiamenti genici indicano proporzioni di equilibrio intorno al 50-55% ST, 30-35% AR e 10-15% CH (fr:6195-6198). L’assenza di cambiamenti percettibili a 16½° C. suggerisce che a quella temperatura i valori adattativi di eterozigoti e omozigoti siano più simili, un effetto della temperatura confermato sperimentalmente (fr:6199, 6200).

L’ultima parte del testo affronta la questione dello stadio del ciclo vitale in cui la selezione opera. In una gabbia di popolazione, se le mosche si accoppiano a caso rispetto all’arrangiamento genico, le proporzioni attese tra le uova sono quelle di Hardy-Weinberg: q² ST/ST : 2q(1 - q) ST/CH : (1 - q)² CH/CH (fr:6208-6210). Campioni di larve nate da uova deposte nelle gabbie ma allevate in bottiglie di coltura in condizioni ottimali mostrano deviazioni relativamente piccole da queste proporzioni attese (fr:6212, 6213). Tuttavia, un campione di mosche adulte della gabbia ha rivelato scostamenti significativi: gli eterozigoti ST/CH risultavano considerevolmente più frequenti, e gli omozigoti meno frequenti, di quanto atteso in base alla formula di Hardy-Weinberg (fr:6216). Questo dato permette di trarre una conclusione puntuale: “a differential elimination of ST/ST and CH/CH homozygotes at some time between the egg and the adult stage may be regarded established” - (fr:6217) [un’eliminazione differenziale degli omozigoti ST/ST e CH/CH in un momento compreso tra lo stadio di uovo e quello adulto può essere considerata accertata.].

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